張曉榮 王 婧 李夢俊 田嵩浩 高艷萍

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院,汾陽 032200)

骨骼肌衛(wèi)星細胞是位于骨骼肌基底膜和肌膜之間的成體祖細胞，可表達配對盒蛋白3(paired box 3，PAX3)、配對盒蛋白7(paired box 7，PAX7)等。當骨骼肌受到刺激時，PAX7陽性的衛(wèi)星細胞被激活，生成大量的成肌細胞，為骨骼肌的維持、再生、修復(fù)提供肌核與肌纖維。小鼠C2C12成肌細胞是來源于骨骼肌衛(wèi)星細胞的肌源細胞，廣泛用于肌肉再生的體外模型研究。大量研究表明，癌癥、惡病質(zhì)、糖尿病、敗血癥、衰老等可導(dǎo)致骨骼肌干細胞衰老、肌源細胞干性和功能喪失、肌纖維丟失，骨骼肌大量丟失可引起肌肉萎縮、失能，甚至死亡[1]。因此，對肌源細胞的正向調(diào)控是防治肌肉萎縮相關(guān)疾病的基礎(chǔ)。而目前臨床上缺乏有效預(yù)防和治療骨骼肌衰老萎縮的藥物。熊果酸是一種五環(huán)三萜類天然化合物，大量研究發(fā)現(xiàn)其對肥胖、糖尿病、抗炎癥、抗氧化反應(yīng)及乳腺癌、肺癌等腫瘤都有作用[2-5]。有研究表明在饑餓誘導(dǎo)的肌肉衰老模型中，熊果酸可以抑制肌肉衰老相關(guān)基因的表達，抑制骨骼肌衰老[6]。此外，熊果酸可以促進肌肉衰老大鼠的腓腸肌量增多[7]。熊果酸可以刺激胰島素樣生長因子(insulin like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)的表達,增強蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、哺乳動物雷帕霉素受體(mammalian target of rapamycin，mTOR)、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等表達促進肌肉肥大[8]。熊果酸對肌肉調(diào)控作用的機制目前尚不清楚，本實驗通過研究熊果酸對C2C12成肌細胞的調(diào)控作用及機制，為骨骼肌萎縮的治療及預(yù)防提供新的策略和參考。

1 材料與方法

1.1材料 C2C12細胞株由天津醫(yī)科大學(xué)牛凱軍教授惠贈；熊果酸購自南京道斯夫生物公司；3-Methyladenine(3-MA，HY-19312)購自MCE公司；細胞培養(yǎng)基、CCK8試劑盒、二抗、DAPI染色液、熒光二抗購自博士德公司；EdU-488細胞增殖試劑盒購自碧云天公司；細胞周期檢測試劑盒購自索萊寶公司；PAX7、P62、LC3B、P16單克隆抗體均購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物處理 C2C12細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。不同濃度(0.1、0.5、1.5、10 μg/ml)熊果酸處理后利用CCK8檢測細胞增殖情況。研究熊果酸(0.5、1 μg/ml)對細胞自噬水平的影響，后續(xù)實驗選用1 μg/ml熊果酸處理細胞。

1.2.2CCK8細胞增殖實驗 C2C12細胞以初始密度1×104個/孔接種到96孔板中，邊緣孔用PBS覆蓋。24 h后用不同濃度熊果酸(0.1、0.5、1、5、10 μg/ml)培養(yǎng)細胞24 h，每孔加入10 μl CCK8溶液后繼續(xù)孵育1 h。酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值。

1.2.3Western blot 熊果酸處理過的細胞用PBS清洗后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒對蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量進行12% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗在4℃過夜，使用TBST洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，最后加入發(fā)光液，于凝膠成像儀曝光拍照并統(tǒng)計灰度值，計算PAX7、P62、LC3B、P16蛋白相對表達量。

1.2.4EdU-488檢測細胞增殖 6孔板中熊果酸和3-MA處理完成后，加入EdU工作液繼續(xù)孵育 2 h，去除培養(yǎng)液后，每孔加入1 ml固定液，室溫固定15 min。去除固定液，用3% BSA的PBS洗滌 3次。棄洗滌液，0.3%Triton X-100室溫孵育15 min，洗滌液洗滌3次。棄洗滌液，每孔加入500 μl Click反應(yīng)液室溫避光孵育30 min，洗滌液洗滌3次。棄洗滌液，每孔加入1 ml Hoechst室溫避光孵育10 min，洗滌液洗滌3次后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期 細胞經(jīng)熊果酸和3-MA處理后，收集1×106個細胞并用預(yù)冷70%乙醇4℃過夜固定。第2天用PBS洗去固定液，4℃以1 000 r/min離心10 min，沉淀中加入100 μl RNase A溶液重懸，37℃水浴30 min。避光條件下，每管加入400 μl PI，4℃孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6免疫熒光 細胞經(jīng)熊果酸和3-MA處理后，PBS洗滌3次，每次5 min。用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。用0.5%Triton X-100室溫通透20 min，1% BSA室溫封閉1 h后，加入一抗4℃孵育過夜。第2天用熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次后，DAPI室溫孵育10 min，PBS洗滌3次后熒光顯微鏡觀察P62表達。

2 結(jié)果

2.1熊果酸對C2C12細胞生長增殖能力的影響 采用CCK8方法，檢測不同濃度(0.1、0.5、1、5、10 μg/ml)熊果酸對C2C12細胞增殖的影響。當熊果酸濃度<1 μg/ml時促進C2C12細胞增殖，濃度>5 μg/ml時，熊果酸對細胞生長增殖的促進作用消失，并在10 μg/ml高濃度組表現(xiàn)出細胞毒性作用。與Control組相比，10 μg/ml熊果酸組C2C12細胞貼壁數(shù)目減少，細胞密度明顯降低，背景中可見大量細胞碎片，細胞萎縮并逐漸變圓，胞質(zhì)減少，見圖1。

圖1 不同濃度熊果酸對C2C12細胞增殖能力的影響Fig.1 Effects of ursolic acid with different concentrations on C2C12 cells proliferationNote:*.P<0.05 vs Control.

2.2Western blot檢測熊果酸對C2C12細胞中PAX7蛋白表達的影響 Western blot檢測0.5、1 μg/ml熊果酸干預(yù)的C2C12細胞中PAX7蛋白的表達情況。如圖2所示，與Control組相比，熊果酸(0.5、1 μg/ml)組PAX7蛋白表達量明顯增加[81.20±6.39，86.57±6.84 vs 47.43±3.31]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Western blot檢測PAX7蛋白表達Fig.2 Expression of PAX7 protein was tested by Western blotNote:*.P<0.05 vs Control.

2.3熊果酸對自噬相關(guān)蛋白表達的影響 通過Western blot實驗檢測熊果酸對C2C12細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響。如圖3所示，與Control組相比，熊果酸(0.5、1 μg/ml)組P62蛋白表達量明顯下降[83.56±11.72，76.48±7.83 vs 89.83±10.04]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著增加[79.56±1.45，117.06±2.49 vs 53.81±0.83]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測細胞自噬相關(guān)蛋白表達Fig.3 Expressions of autophagy-related proteins were tested by Western blotNote:*.P<0.05 vs Control.

2.43-MA抑制自噬水平 使用1 mmol/L 3-MA提前1 h預(yù)處理細胞，采用Western blot和免疫熒光實驗檢測自噬水平變化。如圖4A、表1所示，與Control組相比，3-MA組P62蛋白表達上升，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達下降。與UA組相比，UA(1 μg/ml)+3-MA組P62蛋白表達上升，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達上升，表明自噬流被阻斷。與3-MA組相比，UA(1 μg/ml)+3-MA組P62蛋白表達下降，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達上升。如圖4B中免疫熒光結(jié)果所示，與Control組相比，3-MA組P62在胞質(zhì)中顆粒聚集。與3-MA組相比，UA(1 μg/ml)+3-MA組P62熒光聚集減少，熒光強度降低。

圖4 Western blot和免疫熒光檢測蛋白表達Fig.4 Expression of proteins were tested by Western blot and immunofluorescence assay

表1 各組細胞相關(guān)蛋白表達Tab.1 Expressions of cell-related proteins in different

2.5熊果酸通過自噬促進C2C12細胞增殖 通過EdU-488檢測自噬抑制后，熊果酸對C2C12細胞增殖的影響。圖5結(jié)果顯示，與Control組相比，UA(1 μg/ml)組綠色熒光細胞數(shù)明顯增加[50.87±1.44 vs 36.75±4.31]。與UA(1 μg/ml)組相比，3-MA組綠色熒光細胞數(shù)減少[33.85±1.37 vs 50.87±1.44；P<0.05]，UA (1 μg/ml)+3-MA組綠色熒光細胞數(shù)減少[37.32±3.99 vs 50.87±1.44；P<0.05]，而3-MA組與UA (1 μg/ml)+3-MA組綠色熒光細胞數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 EdU-488檢測細胞增殖改變Fig.5 Cell proliferation was detected by EdU-488Note: *.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs UA(1 μg/ml).

2.6熊果酸通過自噬促進PAX7蛋白表達 Western blot檢測熊果酸和3-MA干預(yù)的C2C12細胞中PAX7蛋白的表達情況。如圖4A、表1所示，與UA(1 μg/ml)組相比，UA(1 μg/ml)+3-MA組PAX7蛋白表達量明顯減少,但其表達量較3-MA組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7熊果酸通過自噬影響細胞周期 熊果酸和3-MA干預(yù)C2C12細胞后，Western blot檢測P16蛋白的表達情況，流式細胞儀檢測細胞周期變化。如圖4A、表1所示，UA(1 μg/ml)組P16蛋白表達量較Control組減少；UA(1 μg/ml)+3-MA組的P16蛋白表達量較Control組和UA(1 μg/ml)組顯著增加。如圖6、表2所示，UA(1 μg/ml)組G1/G0期細胞較Control組減少，UA(1 μg/ml)+3-MA組G1/G0期細胞較UA(1 μg/ml)組增加。

圖6 流式細胞儀檢測細胞周期時相分布Fig.6 Cell cycle phase was examined by flow cytometry

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期分布Tab.2 Cell cycle distribution of each group was detected by flow

3 討論

多種慢性疾病、消耗性疾病以及衰老等容易引起骨骼肌萎縮，導(dǎo)致骨骼肌功能喪失甚至死亡。骨骼肌衛(wèi)星細胞作為骨骼肌的干細胞，對骨骼肌的發(fā)育、維持和修復(fù)至關(guān)重要，近年來有大量研究通過異體移植肌肉衛(wèi)星細胞以修復(fù)骨骼肌的損傷[9]。C2C12成肌細胞是來源于衛(wèi)星細胞的肌源細胞，可以增殖、分化為肌管和肌纖維，是體外研究肌肉再生的最佳模型。

熊果酸是廣泛存在于蘋果皮中的化合物，具有促進癌細胞凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對熱應(yīng)激損傷的心肌細胞具有抗凋亡和抗氧化作用[5]。此外，熊果酸可以抑制骨骼肌衰老的相關(guān)基因的表達，促進肌肉肥大，但其調(diào)控機制目前尚不明確。骨骼肌衛(wèi)星細胞是維持和修復(fù)骨骼肌的關(guān)鍵細胞，本研究通過不同濃度熊果酸干預(yù)小鼠C2C12成肌細胞，發(fā)現(xiàn)濃度小于1 μg/ml的熊果酸具有促進細胞增殖的作用。PAX7是C2C12成肌細胞增殖所必需的蛋白，在骨骼肌干細胞功能的維持和骨骼肌的再生中發(fā)揮重要作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)熊果酸(0.5、1 μg/ml)可以促進PAX7蛋白表達，增強C2C12細胞增殖能力。高濃度熊果酸(10 μg/ml)對C2C12成肌細胞有細胞毒性，可能與凋亡、焦亡或巨胞飲等非凋亡性細胞死亡有關(guān)，其毒性機理有待進一步研究，而在開發(fā)熊果酸相關(guān)藥物時需注意高劑量藥物毒性的影響[11]。

自噬是生物體內(nèi)重要的生物降解程序，可以將受損的細胞器、蛋白、脂質(zhì)降解以維持細胞穩(wěn)態(tài)。自噬在維持肌肉和肌纖維的完整性中發(fā)揮重要的作用，基礎(chǔ)自噬有利于維持骨骼肌干細胞的干性、抑制衰老。自噬功能受損可能是導(dǎo)致肌纖維退化、肌肉萎縮的原因之一，而在肌少癥中增強自噬可以維持肌肉衛(wèi)星細胞的干性，促進肌肉再生[12，13]。有研究表明熊果酸通過增強自噬活性以調(diào)控TLR4/MyD88信號通路，抑制炎癥[14]。熊果酸還通過激活自噬抑制人肺癌細胞A549[15]。P62是細胞自噬底物蛋白，可以靶向其他蛋白進行選擇性的自噬；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)參與自噬體膜延伸以及自噬溶酶體降解過程。本研究發(fā)現(xiàn)熊果酸(0.5、1 μg/ml)促進P62蛋白的降解，抑制P62蛋白的表達，促進LC3Ⅱ蛋白表達，表明熊果酸可以增強細胞自噬活性。

為研究熊果酸對C2C12成肌細胞增殖的促進作用是否靶向自噬，本研究通過自噬抑制劑3-MA阻斷自噬，P62、LC3蛋白結(jié)果表明3-MA預(yù)處理抑制自噬活性，3-MA預(yù)處理的熊果酸組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62表達增加，胞質(zhì)中P62熒光顆粒聚集，自噬溶酶體降解過程被抑制，自噬流受阻。3-MA抑制自噬水平后，通過EdU實驗發(fā)現(xiàn)，EdU摻入顯著減少，熊果酸對增殖的促進作用被抑制；此外，細胞增殖相關(guān)蛋白PAX7表達也較熊果酸組減低。為進一步驗證熊果酸靶向自噬調(diào)控C2C12成肌細胞增殖，本研究通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)熊果酸干預(yù)后，G1/G0期細胞減少，而3-MA抑制自噬活性后，G1/G0期周期相對增多，表明熊果酸在一定程度上影響細胞周期和細胞的有絲分裂進程，且這一過程與細胞自噬激活有關(guān)。P16INK4a是細胞周期G1/S期檢查點的負性調(diào)節(jié)因子，可以阻遏細胞周期進而抑制增殖，熊果酸可以抑制P16蛋白表達，但其抑制作用在3-MA阻斷自噬進程后被逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可以促進小鼠肌源細胞C2C12增殖和自噬，通過3-MA抑制自噬活性后，探討熊果酸對C2C12細胞增殖調(diào)控的機制，發(fā)現(xiàn)熊果酸靶向自噬促進C2C12細胞的增殖，為骨骼肌萎縮的治療及預(yù)防提供了新的思路。