何麗華， 倪麗君， 楊思敏， 羽曉瑜， 周愛萍， 胡 靚， 郭 建， 吳文娟

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院檢驗(yàn)科，上海 200123）

近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）引起的感染不斷增多，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率也在全球迅速升高[1-2]。CRKP在醫(yī)院的暴發(fā)流行是引起醫(yī)院感染患者高死亡率的重要因素[3]。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物最主要的耐藥機(jī)制[4]，KPC型碳青霉烯酶是我國肺炎克雷伯菌臨床分離株中最常見的碳青霉烯酶[5]。快速檢測肺炎克雷伯菌和產(chǎn)碳青霉烯酶基因blaKPC，可以及時(shí)指導(dǎo)臨床抗感染治療，控制耐藥菌在醫(yī)院內(nèi)的傳播和暴發(fā)流行。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦使用改良Hodge試驗(yàn)（modified Hodge test，MHT） 、Carba NP 試驗(yàn)（Carba NP test，CNP）和改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）對產(chǎn)碳青霉烯酶菌株進(jìn)行表型確證[6]，但這些方法操作繁瑣，且進(jìn)口快速分子檢測試劑非常昂貴，不利于常規(guī)開展，無法快速、準(zhǔn)確地為臨床危重患者抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究對某國產(chǎn)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測試劑盒直接檢測臨床樣本中肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白基因blaphoE和blaKPC，快速檢測產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的性能進(jìn)行評估，以期為降低檢測成本提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2014—2016年同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院南院菌毒種庫-70 ℃保存的臨床分離CRKP菌株89株；另收集2017年8月—2018年11月臨床送檢痰液樣本（剔除同一患者重復(fù)送檢的樣本）226份，直接提取核酸，進(jìn)行熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測。同時(shí)收集痰液樣本中分離的肺炎克雷伯菌（剔除分離自同一患者的重復(fù)菌株）。

1.2 儀器與試劑

Vitek 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司），Autof ms 1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（鄭州安圖生物公司），Cobas Z-480型熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），Natch CS s12a型全自動(dòng)核酸提取儀（湖南圣湘生物科技有限公司），T1000 Thermal Cycler型PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc EZ型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素KPC基因檢測試劑盒（熒光PCR法，寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司），細(xì)菌DNA提取試劑盒[凱杰（北京）有限公司]，核酸提取或純化試劑（湖南圣湘生物科技有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；革蘭陰性菌藥物敏感性試驗(yàn)卡（法國生物梅里埃公司）、培養(yǎng)基和藥物敏感性試驗(yàn)紙片、培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片（英國OXOID公司），4% NaOH為本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 在痰液樣本中加入2倍體積的4% NaOH，搖勻，室溫下放置30 min液化，1 256×g離心 5 min。沉淀加1 mL無菌0.9%氯化鈉溶液，混勻，1 256×g離心5 min；去盡上清后沉淀用于核酸抽提。用新鮮菌落配置0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?0 L，置于1.5 mL Eppendorf離心管中，用于核酸抽提。

1.3.2 培養(yǎng)及鑒定 按常規(guī)方法分離培養(yǎng)臨床送檢的痰液樣本，所有分離菌采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定后，參照2018年CLSI推薦的儀器法和紙片擴(kuò)散法進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)[5]。收集培養(yǎng)結(jié)果為肺炎克雷伯菌的樣本和菌株，以及正常菌群生長的痰液樣本。

1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增 采用肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素KPC基因檢測試劑盒提取臨床樣本和細(xì)菌的DNA模板，按照說明書配制試劑和加樣，熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，循環(huán)1次；93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測溫度為60 ℃。選用FAM通道作為blaphoE、blaKPC基因檢測的熒光通道，選用JDE通道作為內(nèi)標(biāo)基因的檢測通道。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 采用PCR擴(kuò)增blaKPC基因，擴(kuò)增產(chǎn)物使用一代測序方法進(jìn)行分析。用新鮮菌落配置0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?00 μL，置于1.5 mL Eppendorf離心管中，采用全自動(dòng)核酸提取儀提取DNA模板。引物序列：F-CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG，R-CTTGTCATCCTTGTTAGGCG；大小為798 bp。反應(yīng)條件為：94 ℃變性10 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精準(zhǔn)概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用四格表進(jìn)行分析，評價(jià)檢測敏感性、特異性和總符合率。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本和菌株信息

226份痰液樣本中有45份分離出CRKP，20份分離出碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-sensitiveKlebsiellapneumoniae，CSKP）。以161份正常菌群生長的痰液樣本作為陰性對照，共收集到肺炎克雷伯菌65株。

2.2 RT-PCR和PCR擴(kuò)增檢測CRKP結(jié)果

89株CRKP經(jīng)RT-PCR檢測和常規(guī)PCR擴(kuò)增，其中87株檢測出blaKPC基因，2株未檢出blaKPC基因，blaKPC基因檢出率為97.8%，2種分子檢測方法符合率為100%，見圖1、圖2。89株CRKP采用RT-PCR均檢測出肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白blaphoE基因，見圖3、表1。

圖1 RT-PCR blaKPC基因檢測結(jié)果

圖2 PCR擴(kuò)增blaKPC基因產(chǎn)物電泳圖

2.3 臨床樣本和菌株熒光PCR檢測結(jié)果

45份檢出CRKP的痰液樣本中均檢出肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白blaphoE基因，其中43份檢出blaKPC基因，2份未檢出blaKPC基因；同時(shí)收集的45株CRKP均檢測出blaphoE基因和blaKPC基因。臨床樣本與菌株檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。20份檢出CSKP的痰液樣本和同步收集的20株CSKP中均檢出blaphoE基因，但菌株中均未檢出blaKPC基因，有1份痰液樣本檢出blaKPC基因，與菌株檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。161份陰性對照樣本均未檢出blaKPC基因，但有1份檢出blaphoE基因，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖4。

圖3 RT-PCR blaphoE基因檢測結(jié)果

表1 89株CRKP RT-PCR和PCR擴(kuò)增結(jié)果 株

2.4 性能評價(jià)

2.4.1 熒光PCR檢測肺炎克雷伯菌blaphoE與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，熒光PCR檢測肺炎克雷伯菌blaphoE的敏感性為100%，特異性為99.38%，2種方法符合率為99.56%。見表2。

圖4 226份痰液樣本與其對應(yīng)菌株RT-PCR檢測結(jié)果

表2 2種方法肺炎克雷伯菌檢測結(jié)果 株

2.4.2 RT-PCR直接檢測痰樣本blaKPC基因 與菌株體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，2種方法符合率為98.67%，RT-PCR的檢測敏感性為95.56%，特異性為99.48%。見表3。

表3 痰液樣本和菌株blaKPC基因檢測結(jié)果 份

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物是治療多重耐藥菌引起的感染的最有效藥物，但近年來碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌，特別是肺炎克雷伯菌的檢出率呈上升趨勢[7-9]，使臨床抗感染治療面臨巨大挑戰(zhàn)。碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白聯(lián)合產(chǎn)頭孢菌素酶β-內(nèi)酰胺酶或產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）、藥物外排機(jī)制或作用靶位的改變[10]。我國碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)blaKPC型碳青霉烯酶，主要流行傳播的克隆株為ST11型[11]。由于目前臨床上尚無特效藥物，因而通過對此類細(xì)菌進(jìn)行快速檢測來及時(shí)指導(dǎo)臨床合理用藥極為重要[12]。

本研究先采用常規(guī)PCR方法驗(yàn)證肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素KPC基因檢測試劑盒檢測89株CRKP菌株blaKPC基因的準(zhǔn)確性，再驗(yàn)證采用RT-PCR檢測痰液樣本中blaphoE基因和blaKPC基因的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，采用RT-PCR檢測89株CRKPblaKPC基因，檢測結(jié)果與常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果基本一致，能夠特異性地?cái)U(kuò)增出87株blaKPC基因，2株未擴(kuò)增出blaKPC基因，可能是由于存在其他碳青霉烯類耐藥基因所致。肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因KPC檢測試劑盒還可以特異地?cái)U(kuò)增blaphoE基因，結(jié)果和臨床鑒定結(jié)果完全一致，而常規(guī)PCR則無此功能。采用RT-PCR對臨床痰液樣本和菌株分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，直接擴(kuò)增痰液樣本blaKPC基因和檢測樣本中分離出CRKP，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；有2株blaKPC基因檢測結(jié)果為假陰性，可能是抽提過程中出現(xiàn)了操作失誤，或因樣本濃度過低所致，檢出CSKP的痰液樣本中檢出1株blaKPC基因假陽性，陰性對照樣本中檢出1株blaphoE假陽性，可能是由于操作人員操作不當(dāng)，或反應(yīng)液分裝冷凍、加樣后未及時(shí)蓋緊瓶蓋導(dǎo)致污染所致。

總體而言，本研究226份痰液樣本中，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，RT-PCR檢測肺炎克雷伯菌blaphoE的敏感性為100%，特異性為99.38%，2種方法的符合率為99.56%；與體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較，RT-PCR直接檢測痰液樣本blaKPC基因的敏感性為95.56%、特異性為99.48%，2種方法的符合率為98.67%。提示RT-PCR具有較好的檢測性能，與常規(guī)PCR測序方法比較，僅需2～3 h即可出結(jié)果，具有高效、便捷的優(yōu)點(diǎn)，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素KPC基因檢測試劑盒（熒光PCR法）可快速篩查產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，可快速為重癥感染患者提供感染治療依據(jù)，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。