唐 瑜， 沈平華， 史保慶， 蔣曉飛

（1. 上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200030；2. 上海市第一婦嬰保健院檢驗(yàn)科，上海 200040；3. 棗莊市市中區(qū)礦務(wù)局醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 棗莊 277100）；4. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）引起的臨床感染在全球范圍內(nèi)均有報(bào)道，由于可選的抗菌藥物十分有限，CRE已成為臨床抗感染治療面臨的重大挑戰(zhàn)[1]。多黏菌素被認(rèn)為是治療CRE感染的最后一道防線，但其耐藥率也呈逐漸上升趨勢。目前實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測方法（紙片擴(kuò)散法、E試驗(yàn)和儀器法等）無法有效、準(zhǔn)確地檢出多黏菌素耐藥菌株[2-5]，微量肉湯稀釋法操作繁瑣，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力[2]。NORDMANN等[6]建立的Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)操作簡便，可以在2～4 h內(nèi)快速檢出對(duì)多黏菌素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。本研究擬對(duì)臨床分離的461株腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)初篩，并采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及測序法分析各菌株多黏菌素耐藥機(jī)制，探討Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)在多黏菌素耐藥菌株檢測中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及分類

收集2016年2—6月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院腸桿菌科非重復(fù)臨床分離株，采用VITEK-2 compact微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）對(duì)所有菌株進(jìn)行鑒定。461株腸桿菌科細(xì)菌中，肺炎克雷伯菌292株（63.34%）、大腸埃希菌160株（34.71%）、陰溝腸桿菌7株（1.52%）、產(chǎn)酸克雷伯菌2株（0.43%）。分離自痰液樣本201株（43.60%）、尿液樣本177株（38.39%）、血液樣本24株（5.21%）、引流液樣本21株（4.56%）、膽汁樣本8株（1.74%）、其他樣本30株（6.51%）。

1.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法檢測461株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性，替加環(huán)素耐藥折點(diǎn)參考?xì)W洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）的判讀標(biāo)準(zhǔn)[7]，其他藥物敏感性結(jié)果評(píng)判以美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)2014版要求為標(biāo)準(zhǔn)[8]。采用微量肉湯稀釋法測定菌株對(duì)多黏菌素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并以該結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，與Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自上海臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[6]的方法預(yù)先配制Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)所需溶液。（1）A液：準(zhǔn)確稱量M-H肉湯粉末25 g、酚紅指示劑0.05 g，溶解于800 mL去離子水中，然后用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6.7，加水補(bǔ)足至900 mL。標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，121 ℃高壓滅菌15 min，待恢復(fù)至室溫（22～24℃）后，加入100 mL無菌的10%葡萄糖溶液，混勻后備用。（2）B液：在A液中加入多黏菌素（美國Sigma-Aldrich公司）至終濃度為5 μg/mL。挑取新鮮培養(yǎng)的待測菌株、陰性對(duì)照菌株[大腸埃希菌（ATCC 25922）]和陽性對(duì)照菌株（奇異變形桿菌），用0.9%氯化鈉溶液調(diào)成3.0～3.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在無菌96孔培養(yǎng)板的A1～A6孔中加入150 μL A液，作為每組的生長對(duì)照，在B1～B6孔中加入150 μL B液（含5 μg/mL多黏菌素）；在A1和B1孔中分別加入50 μL 0.9%氯化鈉溶液作空白對(duì)照，A2和B2孔中分別加入50 μL已配制好的大腸埃希菌（ATCC 25922）菌液作陰性對(duì)照，A3和B3孔中分別加入50 μL奇異變形桿菌菌液作陽性對(duì)照，其余每組的A和B孔中分別加入50 μL待測菌株菌液，B孔中多黏菌素終濃度為3.75 μg/mL，在36 ℃條件下孵育4 h，觀察并記錄顏色變化。結(jié)果判讀：當(dāng)空白對(duì)照2孔均為橙色，其余各組生長對(duì)照（A孔）均為黃色，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效；若B孔溶液由橙色變?yōu)辄S色，表示Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，提示該菌對(duì)多黏菌素耐藥。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用高溫煮沸法裂解細(xì)菌，提取總DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr，擴(kuò)增引物見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序進(jìn)一步驗(yàn)證；采用PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯菌染色體上的pmrA、pmrB、phoP、phoQ和mgrB基因，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[9]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中的信息進(jìn)行比對(duì)，分析序列變異性。

表1 擴(kuò)增多黏菌素耐藥基因mcr引物序列

1.5 qRT-PCR

采用qRT-PCR檢測phoP、phoQ、pmrD、pmrC、pmrA、pmrB和pmrK基因的轉(zhuǎn)錄水平。首先將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期[600 nm處吸光度（A）值為0.8～0.9]，取1 mL培養(yǎng)物，按RNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司）說明書要求提取總RNA。采用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒（日本Takara公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和基因轉(zhuǎn)錄的定量檢測，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[9]，以多黏菌素敏感的肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 13883）（購自上海臨床檢驗(yàn)中心）為參考，分析耐藥菌株中雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2016及GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果及多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌檢出情況

461株腸桿菌科細(xì)菌中，Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)篩查顯示13株為陽性，耐藥率為2.81%。其中肺炎克雷伯菌10株，陰溝腸桿菌2株，大腸埃希菌1株，Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)陽性菌株MIC見表2，部分Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。微量肉湯稀釋法藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)陽性的菌株對(duì)多黏菌素的MIC值均達(dá)到耐藥水平，符合率為100%。未發(fā)現(xiàn)2種方法結(jié)果不一致的情況。

表2 Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)陽性菌株信息和多黏菌素MIC結(jié)果

2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

461株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多種頭孢菌素（頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟和頭孢吡肟）、環(huán)丙沙星、哌拉西林的耐藥率＞75%，對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為7.16%。多黏菌素耐藥菌株和敏感菌株對(duì)多種常用抗菌藥物（慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢美唑、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素）的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 部分Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 多黏菌素耐藥菌株的耐藥機(jī)制分析

13株多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌中，mcr基因擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析及測序確認(rèn)，大腸埃希菌ECO1500攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1（圖2）。對(duì)多黏菌素耐藥菌株進(jìn)行雙組分調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因PCR篩查發(fā)現(xiàn)，10株肺炎克雷伯菌均含有pmrA/pmrB和PhoP/PhoQ雙組分調(diào)控系統(tǒng)，2株陰溝腸桿菌和1株大腸埃希菌為陰性。對(duì)10株雙組分調(diào)控系統(tǒng)陽性的肺炎克雷伯菌進(jìn)行pmrA、pmrB、phoP、phoQ和mgrB基因測序及qRT-PCR，結(jié)果顯示有3株（KP1305、KP1542和KP1543）mgrB基因有ISKpn14插入突變，KP340的pmrB位點(diǎn)出現(xiàn)了R256G突變；其余6株pmrK基因表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)，最低為9.6倍，最高為31倍，KP1202和KP199的pmrA、pmrD、phoP和phoQ基因也明顯上調(diào)。各基因的相對(duì)表達(dá)水平見表4。

表3 腸桿菌科細(xì)菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥情況

圖2 mcr基因檢測結(jié)果電泳圖

表4 13株多黏菌素耐藥菌株的耐藥機(jī)制分析

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌是臨床主要的條件致病菌，可引起嚴(yán)重的非社區(qū)性感染，如肺炎、血流感染、腹腔感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等[10]。多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌在全球范圍內(nèi)的廣泛流行已成為臨床抗感染治療的一大難題[11]。多黏菌素（E和B）被認(rèn)為是治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染的最后一道防線[12-13]。近年來，多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌在全球的報(bào)道逐漸增多，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr在社區(qū)和醫(yī)院環(huán)境的出現(xiàn)和快速播散，使得腸桿菌科細(xì)菌的耐藥形勢更為嚴(yán)峻，尤其是在CRE流行的國家和地區(qū)，因此有必要在臨床工作中進(jìn)行多黏菌素藥物敏感性監(jiān)測[5，14]。

目前臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測方法，如紙片擴(kuò)散法、E試驗(yàn)或儀器法等均無法有效檢出多黏菌素耐藥菌株。微量肉湯稀釋法操作繁瑣、耗時(shí)長，難以在實(shí)驗(yàn)室日常工作中進(jìn)行。此外，由于染色體介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，分子檢測方法同樣不適用于多黏菌素耐藥菌株的檢測[2，5]。

Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)可以在2～4 h內(nèi)快速檢出對(duì)多黏菌素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，該方法利用腸桿菌科細(xì)菌生長過程中的糖類代謝特征，即腸桿菌科細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，pH值改變使酸堿指示劑酚紅由橙色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，從而達(dá)到檢測的目的[12]。Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CLSI和EUCAST推薦的微量肉湯稀釋法結(jié)果一樣可靠，但更加簡單、快速，且不需要苛刻的實(shí)驗(yàn)條件，一般的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室均可開展，是非常理想的多黏菌素耐藥菌株監(jiān)測方法。本研究納入的461株腸桿菌科細(xì)菌中，13株多黏菌素耐藥株在2 h內(nèi)均表現(xiàn)為Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)陽性，所有多黏菌素敏感菌株均表現(xiàn)為陰性結(jié)果。13株多黏菌素耐藥株中，肺炎克雷伯菌主要由染色體上的mgrB基因發(fā)生插入突變和雙組分調(diào)控系統(tǒng)pmrA/pmrB、PhoP/PhoQ突變或表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)，大腸埃希菌則由質(zhì)粒攜帶的mcr-1基因介導(dǎo)，而以上多黏菌素耐藥相關(guān)基因在陰溝腸桿菌中均未被檢出，提示陰溝腸桿菌對(duì)多黏菌素的耐藥性由其他機(jī)制介導(dǎo)。上述結(jié)果表明，Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)對(duì)不同機(jī)制的介導(dǎo)的多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌均具有良好的檢出率和準(zhǔn)確性，可以用于多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌的臨床篩查。

相較于歐美國家，我國的多黏菌素耐藥率較低[15-16]。多黏菌素耐藥一般由染色體上的基因突變pmrA/pmrB和PhoP/PhoQ表達(dá)上調(diào)引起，常出現(xiàn)在肺炎克雷伯菌中，但近年來隨著質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因的出現(xiàn)和播散，多黏菌素耐藥性可通過質(zhì)粒介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移在種屬內(nèi)和不同種屬之間傳播，mcr基因主要流行于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中[5，9，16-17]。此外，鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌對(duì)多黏菌素耐藥的報(bào)道和研究也日益增多，但不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬等非發(fā)酵菌無法酵解葡萄糖產(chǎn)酸，因而無法通過Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行臨床篩查和監(jiān)測[6，12，18]。

綜上所述，Polymyxin NP實(shí)驗(yàn)是一種快速、有效的多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌篩查方法，盡管目前我國腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多黏菌素的耐藥率顯著低于歐美國家，但耐藥菌株的日益增多，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因的播散使耐藥性難以控制，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌嚴(yán)重影響著臨床抗感染治療，有必要進(jìn)行多黏菌素耐藥性監(jiān)測，對(duì)該類耐藥細(xì)菌的防控至關(guān)重要。