陳 濤， 徐 曄， 董郭楓， 周 翠， 徐雯雅， 周鐵麗

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325000；2.襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

革蘭陰性菌作為臨床最常見的機會致病菌，廣泛存在于醫(yī)院和自然環(huán)境中。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，以及革蘭陰性菌易獲得耐藥基因的特性，導致其耐藥性不斷增強，逐漸成為一種嚴重的全球公共衛(wèi)生威脅[1]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療革蘭陰性菌感染的首選，近年來也出現(xiàn)越來越多的耐藥菌株，使抗感染形勢愈加嚴峻。產(chǎn)生各類β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因[2]。阿維巴坦（avibactam，AVI）是一種新的非β-內(nèi)酰胺類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，屬于二氮雜二環(huán)辛烷（diazabicyclooctane，DBO）類化合物，與臨床使用的抑制劑比較，AVI具有抑酶效果更好、抑菌譜廣的優(yōu)點。2015年2月，AVI與三代頭孢菌素——頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）在美國組合上市，主要用于治療復雜的泌尿道感染，以及聯(lián)合甲硝唑治療復雜的腹腔內(nèi)感染。該復合藥物對革蘭陰性菌感染有著良好的治療效果[3-4]，為臨床治療碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌感染提供了良好的治療選擇。磷霉素是一種可阻礙細菌細胞壁合成的低分子化合物，在美國被批準用于治療由革蘭陽性和革蘭陰性菌引起的尿路感染。磷霉素與β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合治療多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）革蘭陰性菌感染正引起研究者們的廣泛關(guān)注，有研究結(jié)果表明，磷霉素和β-內(nèi)酰胺類（碳青霉烯類和頭孢洛扎-他唑巴坦）之間具有協(xié)同作用[5-6]。

目前，我國CAZ/AVI對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的抗菌作用鮮有報道，故本研究收集臨床感染最常見的3種革蘭陰性菌——大腸埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），評價CAZ/AVI單獨和聯(lián)合磷霉素對這3種碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性，為臨床合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2014—2017年溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌（carbapenemresistantEscherichia coli，CREC）56株、碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）43株和碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）53株，以碳青霉烯敏感大腸埃希菌（carbapenem-susceptibleEscherichia coli，CSEC）51株、碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-susceptibleKlebsiella pneumoniae，CSKP）43株和碳青霉烯敏感銅綠假單胞菌（carbapenem-susceptiblePseudomonas aeruginosa，CSPA）51株作為對照，合計297株。56株CREC中，31株產(chǎn)NDM金屬酶，14株產(chǎn)KPC-2酶，11株不產(chǎn)碳青霉烯酶；43株CRKP中，40株產(chǎn)KPC-2酶，1株產(chǎn)IMP酶，2株同時產(chǎn)KPC-2和IMP酶；53株CRPA均不產(chǎn)碳青霉烯酶。所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定，根據(jù)VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀的藥物敏感性試驗結(jié)果，按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）最新標準進行判讀，細菌對碳青霉烯類藥物中的任意一種耐藥即納入本研究。所有碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌都經(jīng)過CLSI推薦的改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）確認碳青霉烯酶表型和基因型[7]。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 抗菌藥物

CAZ、阿維巴坦鈉（上海源葉生物科技有限公司），磷霉素、葡萄糖-6-磷酸二鈉（溫州康泰生物技術(shù)公司）。

1.3 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀及配套細菌鑒定GNS卡和GN卡、比濁儀（法國生物梅里埃公司），10 μg美羅培南紙片、哥倫比亞血瓊脂、M-H瓊脂培養(yǎng)基和M-H肉湯培養(yǎng)基（英國OXOID公司）、PCR擴增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、PCR反應儀和脈沖場凝膠電泳儀（美國BIO-RAD公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗醫(yī)療器械廠）、90 mm 塑料平皿（溫州倍可特公司）、96孔板（美國康寧公司）、超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器公司）。

1.4 方法

1.4.1 瓊脂稀釋法檢測菌株對CAZ/AVI的敏感性 采用CLSI 2018年推薦瓊脂二倍稀釋法[7]測定待檢菌株對CAZ/AVI的敏感性。CAZ/AVI的濃度測定范圍為0.12/4 μg/mL～128/4 μg/mL。將分離純化后的臨床分離株及質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）接種于血平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～18 h后，從新鮮過夜的培養(yǎng)板上挑取單個菌落于2 mL M-H肉湯中，置于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱200 r/min培養(yǎng)6～8 h，用無菌M-H肉湯將菌液調(diào)至0.5麥氏濁度后將其10倍稀釋，接種到M-H瓊脂平板上，每點接種量為1×104CFU，分別測定CAZ/AVI對各菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。結(jié)果依據(jù)2018版CLSI藥物折點判讀標準進行判斷[7]，腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌對CAZ/AVI的MIC≥16/4 μg/mL判斷為耐藥，≤8/4 μg/mL則判斷為敏感。

1.4.2 微量棋盤稀釋法檢測CAZ/AVI和磷霉素的聯(lián)合抗菌作用 采用微量棋盤稀釋法測定CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素后的聯(lián)合抗菌作用[8]。將CAZ/阿維巴坦鈉按臨床使用的比例（4∶1）配成復合藥物，根據(jù)菌株的MIC值將CAZ/AVI和磷霉素分別配置成一定濃度的原液，使最終組合的藥物濃度分別為2/0.5 μg/mL～256/64 μg/mL和1 μg/mL～2 048 μg/mL，并保證每個孔里包含有25 μg/mL的葡萄糖-6-磷酸二鈉。按照棋盤法設計，每孔分別加入50 μL CAZ、AVI和磷霉素，同時加入100 μL稀釋后的菌液，37℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各組合和最佳組合時各種藥物的MIC（甲藥聯(lián)用的MIC和乙藥聯(lián)用的MIC）值，并計算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）值。聯(lián)合用藥的兩藥相互作用效果主要采用FICI進行評價，F(xiàn)ICI=FIC甲藥+FIC乙藥=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用[FIC為部分抑菌濃度（fractional ihibitory concentration）]。FICI判斷標準為：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1.0為相加作用，1.0＜FICI≤2.0為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2.0為拮抗作用。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CAZ/AVI對碳青霉烯類耐藥和敏感革蘭陰性菌的體外抗菌活性

297株革蘭陰性菌對CAZ/AVI的總耐藥率為18.18%，其中152株碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對CAZ/AVI的耐藥率為30.26%，顯著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中，碳青霉烯類耐藥菌株對CAZ/AVI的耐藥率（39.29%和37.74%）顯著高于碳青霉烯敏感菌株（1.96%和7.84%）（P＜0.05）；然而在肺炎克雷伯菌中，CRKP對CAZ/AVI的耐藥率為9.30%，與CSKP（6.98%）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CRKP對CAZ/AVI的耐藥率（9.30%）顯著低于CREC和CRPA（39.29%和37.74%）（P＜0.05）。見表1。對CAZ/AVI敏感的CRKP的總體MIC分布要較CREC更接近于耐藥折點（P＜0.05），見表2。產(chǎn)NDM金屬酶的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對CAZ/AVI的耐藥率為67.74%，顯著高于產(chǎn)KPC-2酶（7.41%）和不產(chǎn)酶（32.81%）的碳青霉烯類耐藥菌株（P＜0.05），見表3。

2.2 CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性

從耐CAZ/AVI的3種碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌中各隨機挑選3株菌株（CREC：DC2003、DC7969、DC8085；CRKP：FK2784、FK2938、FK2993；CRPA：TL2855、TL2864、TL2867）進行微量棋盤稀釋法藥物敏感性試驗。結(jié)果顯示，9株碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌中，CAZ/AVI和磷霉素聯(lián)用后，2種藥物的MIC值較單用時均有所降低。在CREC中，CAZ/AVI與磷霉素聯(lián)用后的FICI均分布在0.5～1.0的范圍內(nèi)，均表現(xiàn)為相加作用。在CRKP與CRPA中，CAZ/AVI與磷霉素聯(lián)用后的FICI均≤0.5，均表現(xiàn)為協(xié)同作用。見表4。

表1 革蘭陰性菌對CAZ/AVI的耐藥情況

表2 CAZ/AVI敏感不同碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌MIC分布情況比較 株

表3 CAZ/AVI對不同表型/基因型革蘭陰性菌的耐藥情況

表4 CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素的MIC值及其FICI

3 討論

細菌耐藥性的增強是一個嚴重的全球公共衛(wèi)生問題，由耐藥細菌引起的感染有著較高的發(fā)病率和病死率。目前，MDR革蘭陰性菌，尤其是碳青霉烯類耐藥的革蘭陰性菌，是醫(yī)院和社區(qū)感染的一大威脅[9]。由于細菌對經(jīng)典抗菌藥物的耐藥率不斷增高，學者們開始關(guān)注臨床上新的抗菌藥物以對抗這些棘手的耐藥菌株。β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合因?qū)Ξa(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株具有良好的抑菌作用而得到研究者們的關(guān)注。早前使用的經(jīng)典酶抑制劑通過與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，形成穩(wěn)定的非共價化合物達到抑酶作用，但同時自身結(jié)構(gòu)也遭到破壞。而新的酶抑制劑AVI卻具備獨特的抑酶機制，其與β-內(nèi)酰胺酶共價結(jié)合后，可再經(jīng)環(huán)合使自身結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，因此具有更長效的抑酶作用[10]。同時，AVI的抑酶譜更廣，可有效抑制Ambler A類、C類和部分D類β-內(nèi)酰胺酶[11]。CAZ/AVI作為新的β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合，對MDR革蘭陰性菌有著良好的抗菌作用[12]。因此，本研究對該復合藥物進行研究，以期能應對臨床棘手的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌。

本研究結(jié)果顯示，3種革蘭陰性菌對CAZ/AVI的總耐藥率為18.18%，較國外報道的耐藥率更高[13]。此外，碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對CAZ/AVI的總耐藥率高達30.26%，顯著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。CAZ/AVI作為除多黏菌素以外最有前景的復合藥物，目前已存在這么高比例的耐藥菌株，提示臨床上革蘭陰性菌的耐藥形勢已經(jīng)非常嚴峻。CREC對CAZ/AVI的耐藥率高達39.29%，與大腸埃希菌主要產(chǎn)AVI無法抑制的NDM金屬酶有關(guān)，本研究中，產(chǎn)NDM金屬酶的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對CAZ/AVI的耐藥率為67.74%，與國外的研究結(jié)果相似[14]；CRPA的耐藥率達37.74%也與銅綠假單胞菌幾乎不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)；而CRKP對CAZ/AVI展現(xiàn)出了良好的敏感率，這與AVI可以顯著抑制KPC-2酶有著密切的關(guān)系，與國內(nèi)外文獻報道相符[15-16]。本研究結(jié)果還顯示，在腸桿菌科細菌中，雖然CRKP對CAZ/AVI的耐藥率明顯低于CREC，但對CAZ/AVI敏感的CRKP的總體MIC分布卻較CREC更接近于CLSI規(guī)定的耐藥折點。這可能意味著未來幾年，同時耐碳青霉烯和CAZ/AVI的肺炎克雷伯菌將會不斷出現(xiàn)，造成可供使用的抗菌藥物進一步減少。

磷霉素對革蘭陰性菌具有良好的殺菌作用。在一些國家，靜脈注射磷霉素已被用于治療包括肺炎在內(nèi)的各種類型的感染[17-18]。同時，磷霉素因其單獨使用時耐藥性突變產(chǎn)生的頻率較高，因此經(jīng)常被選作聯(lián)合用藥的對象之一。有研究結(jié)果表明，合理的聯(lián)合用藥比單藥治療更靈活，并且可降低單藥治療時發(fā)生的單藥耐藥性的風險，緩解臨床治療壓力[19]。因此，為了解決單獨使用CAZ/AVI時耐藥率較高的問題，以及避免新的CAZ/AVI耐藥菌株的出現(xiàn)，本研究考慮了一種聯(lián)合用藥方案——CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素，并進行了棋盤實驗以驗證該方案的可行性，結(jié)果表明CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素在體外對CRKP和CRPA表現(xiàn)為協(xié)同作用，不存在無關(guān)和拮抗作用，與文獻報道結(jié)果[8，20]相符，證實了本研究對CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素抗菌效果的猜想，通過AVI靶向抑制β-內(nèi)酰胺酶，CAZ和磷霉素可以無阻礙地破壞細菌細胞壁，從而使用2種不同的策略殺死細菌。但本研究中CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素對2株產(chǎn)NDM金屬酶的CREC只顯示出相加作用，也從側(cè)面反映了該聯(lián)合方案的局限性是缺乏對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細菌的有效作用。為了克服這一困境，有研究人員提出了CAZ/AVI聯(lián)合氨曲南的策略。氨曲南是一種單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，由于其對青霉素結(jié)合蛋白的強效和特異性親和力，因此不會被金屬β-內(nèi)酰胺酶水解，同時保留了對許多革蘭陰性菌的抗菌活性，但氨曲南容易被大多數(shù)絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶水解，因此AVI的加入正好解決了這一問題。近期也有研究結(jié)果表明CAZ/AVI聯(lián)合氨曲南對包括產(chǎn)NDM酶大腸埃希菌在內(nèi)的產(chǎn)金屬酶腸桿菌科細菌表現(xiàn)出協(xié)同作用[21]。但鑒于體外藥物敏感性試驗與人體內(nèi)真實情況存在一定差異，以及患者感染程度、藥物特性、實驗菌株數(shù)量及認知水平的局限性，對于這些聯(lián)合用藥方案的臨床價值還需進行深入探究，以評估其臨床有效性和安全性，為碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的治療奠定基礎。

綜上所述，CAZ/AVI對CRKP有著良好的體外抗菌活性，可以作為臨床治療CRKP的首選抗菌藥物之一。此外，CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素可能成為一種治療3種常見碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的新的治療策略，但效果需要進一步的評估。