李世榮， 林怡菁， 蔣曉飛， 關(guān) 明

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）是指對任何一種碳青霉烯類抗菌藥物（厄他培南、多尼培南、亞胺培南、美羅培南）耐藥或能夠產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌[1]。CRE是醫(yī)院感染常見的病原菌之一，在全球范圍內(nèi)的定植率和感染率呈逐年上升趨勢，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題[2]。CRE的定植常先于CRE的感染或與感染并存，對入院患者進(jìn)行CRE的主動篩查并對陽性患者采取一定的措施是預(yù)防CRE感染與傳播的有效途徑。本研究采用雙濃度聯(lián)合改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）對231株腸桿菌科細(xì)菌臨床分離株進(jìn)行CRE的篩查，并與VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，評價雙濃度聯(lián)合mCIM篩查CRE的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2018年10月—2019年8月華山醫(yī)院231株腸桿菌科細(xì)菌非重復(fù)（剔除同一患者同次住院第二次分離到的同種菌屬）臨床分離株，其中肺炎克雷伯菌183株、大腸埃希菌32株、陰溝腸桿菌13株、弗氏枸櫞酸桿菌2株、產(chǎn)酸克雷伯菌1株。

1.2 儀器和試劑

M-H瓊脂、血瓊脂平板和抗菌藥物紙片（英國Oxoid公司），VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀、GN革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡和AST-N335革蘭陰性細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)卡（法國生物梅里埃公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定 病原菌分離嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）進(jìn)行，細(xì)菌鑒定采用VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（BAA 1705）、肺炎克雷伯菌（BAA 1706）、陰溝腸桿菌（ATCC 700323）、嗜麥芽窄食單胞菌（ATCC 17666）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）為產(chǎn)碳青酶烯酶陽性菌株，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）為產(chǎn)碳青酶烯酶陰性菌株。肺炎克雷伯菌HS 11286經(jīng)測序驗(yàn)證為KPC陽性、絲氨酸碳青霉烯酶產(chǎn)生株。肺炎克雷伯菌17-w2-89，經(jīng)測序驗(yàn)證為IMP陽性、金屬β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生株。

1.3.2 雙濃度篩查法[3]取2支含5 mL TSB肉湯的試管，分別加入10 μL 和20 μL的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)液1 mg/mL，終濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL，用1 μL接種環(huán)將待測菌株接種于以上2支試管中，35 ℃ CO2孵箱過夜。將2個濃度的培養(yǎng)液用1 μL接種環(huán)分別轉(zhuǎn)種于中國藍(lán)瓊脂平板，繼續(xù)孵育過夜，觀察中國藍(lán)平板中菌落生長情況以及菌落形態(tài)：2個濃度均不生長，則為CRE陰性；2個濃度均生長，為CRE陽性；2 μg/mL濃度生長、4 μg/mL濃度不生長，通過mCIM確認(rèn)CRE。

1.3.3 mCIM （1）操作步驟。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019年版的操作標(biāo)準(zhǔn)，用1 μL接種環(huán)挑1滿環(huán)生長于血瓊脂平板上的過夜培養(yǎng)純待測菌落于2 mL TSB肉湯中，震蕩10～15 s，每管放入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認(rèn)紙片浸沒于菌懸液中，35℃±2℃大氣環(huán)境孵育4 h±15 min。孵育結(jié)束立即用營養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶液制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌（ATCC 25922）菌懸液（直接菌懸法），涂布于M-H平板中（菌懸液制備和平板涂布必須15 min內(nèi)完成，干燥3～10 min），用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，將紙片貼于試管內(nèi)壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板上，35℃±2℃大氣環(huán)境孵育18～24 h，測量抑菌圈直徑。（2）判斷標(biāo)準(zhǔn)。美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落時，為碳青酶烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19 mm，為碳青酶烯酶陰性；抑菌圈直徑為16～18 mm或直徑為≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，無法判斷是否存在碳青酶烯酶，則為碳青酶烯酶不確定[3]。

1.3.4 乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（ethylenediamine tetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM） （1）操作步驟。mCIM結(jié)果為陽性時，取第2支含2 mL TSB肉湯的試管，加入20 μL濃度為0.5 mol/L的乙二胺四乙酸溶液，乙二胺四乙酸最終濃度為5 mmol/L；余下步驟同mCIM。（2）判斷標(biāo)準(zhǔn)。eCIM與mCIM結(jié)果比較，美羅培南抑菌圈直徑相差≥5 mm為金屬β-內(nèi)酰胺酶陽性；美羅培南抑菌圈直徑相差≤4 mm為金屬β-內(nèi)酰胺酶陰性，待測菌株產(chǎn)絲氨酸碳青酶烯酶；忽略任何抑菌圈內(nèi)的散在針尖樣菌落[3]。

2 結(jié)果

2.1 儀器分析結(jié)果

231株腸桿菌科細(xì)菌中，儀器鑒定出有52株對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，根據(jù)CLSI給出的定義，即52株為CRE，陽性檢出率為22.5%。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）為產(chǎn)碳青酶烯酶陽性菌株，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）為產(chǎn)碳青酶烯酶陰性菌株。見表1。

表1 231株腸桿菌科細(xì)菌各種篩查方法的篩查結(jié)果

2.2 mCIM篩查結(jié)果

231株腸桿菌科細(xì)菌中mCIM篩出陽性菌株52株，陽性率為22.5%。其中1株陰溝腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌儀器分析結(jié)果為CRE，而mCIM結(jié)果為陰性；1株肺炎克雷伯菌和1株大腸埃希菌mCIM陽性，而儀器分析結(jié)果為對碳青霉烯類抗菌藥物中介。以儀器分析結(jié)果為參考，mCIM符合率為98.3%，敏感性為96.3%，特異性為98.9%。肺炎克雷伯菌（BAA 1705）mCIM陽性，肺炎克雷伯菌（BAA 1706）mCIM陰性。

2.3 雙濃度聯(lián)合mCIM篩查結(jié)果

231株腸桿菌科細(xì)菌中，2個濃度（2 μg/mL和4 μg/mL）均生長的有50株；2個濃度（2 μg/mL和4 μg/mL）均不生長的有172株；2 μg/mL生長而4 μg/mL不生長的有9株，對這9株菌繼續(xù)進(jìn)行mCIM，篩出3株含有碳青霉烯酶，而另外6株碳青霉烯酶陰性。最后結(jié)果為：CRE陽性菌株53株，陰性菌株178株，陽性率為22.9%。以儀器分析結(jié)果為參考，符合率為98.7%，敏感性為98.1%，特異性為98.9%。

2.4 eCIM篩查結(jié)果

將mCIM試驗(yàn)陽性的52株細(xì)菌繼續(xù)進(jìn)行eCIM，結(jié)果顯示有13株eCIM陽性，即金屬酶在碳青霉烯酶中的陽性率為25%。

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機(jī)制主要有：（1）產(chǎn)碳青霉烯酶，這是腸桿菌科細(xì)菌最常見的耐藥機(jī)制[4-5]。按照Ambler分子分類方法可將碳青霉烯酶分為A、B、D 3類，A類酶中的KPC，B類酶中的NDM、VIM和IMP，以及D類酶中的OXA-48是腸桿菌科細(xì)菌中最常見的碳青霉烯酶。A、D類碳青霉烯酶活性位點(diǎn)含絲氨酸殘基，故稱之為絲氨酸酶；B類碳青霉烯酶活性位點(diǎn)含1～2個Zn2+，故稱之為金屬β-內(nèi)酰胺酶[6]。編碼碳青霉烯酶的基因常位于可移動的遺傳元件上，從而使其耐藥性極易在同種甚至異種菌株之間播散，造成感染的局部暴發(fā)和流行[7]。（2）產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或產(chǎn)頭孢菌素酶合并外膜孔蛋白缺失或變異。（3）碳青霉烯類抗菌藥物的作用靶位發(fā)生改變。（4）細(xì)菌外排泵系統(tǒng)的改變。由外排泵和膜孔蛋白表達(dá)改變引起的細(xì)胞膜通透性改變可單獨(dú)或/和合并產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶引起腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。RND外排泵中的AcrAB-TolC系統(tǒng)是腸桿菌科細(xì)菌對包括碳青霉烯類在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一。其中AcrAB突變、AraC調(diào)節(jié)子過表達(dá)等導(dǎo)致的外排泵表達(dá)增多，以及膜孔蛋白OmpK、OmpC、OmpF等的突變、缺失都可引起肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等的碳青霉烯類最小抑菌濃度升高[8]。

本研究中，有1株陰溝腸桿菌和1株肺炎克雷伯菌儀器分析結(jié)果為CRE，而mCIM結(jié)果為陰性，提示這2株細(xì)菌有可能是非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，而是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶合并外膜蛋白的缺失或變異，或者是碳青霉烯類抗菌藥物的作用靶位發(fā)生改變；另有1株肺炎克雷伯菌和1株大腸埃希菌mCIM結(jié)果為陽性，而儀器分析結(jié)果為對碳青霉烯類抗菌藥物中介，可能是所含碳青霉烯酶的活性比較低所致。

CRE是當(dāng)前最受關(guān)注的耐藥威脅之一，我國CRE的流行情況也比較嚴(yán)重。全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，2018年肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率全國平均為10.1%，河南省最高（32.5%）[9]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測耐藥菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶，對于臨床治療和醫(yī)院感染控制至關(guān)重要。

Carba NP試驗(yàn)是基于碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗菌藥物β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解作用進(jìn)行的比色檢驗(yàn)，10 min～2 h就能觀測結(jié)果，但操作較為繁瑣，需要配制特定的試劑，并且對產(chǎn)OXA-48型碳青霉烯酶細(xì)菌的敏感性低[10-12]。聚合酶鏈反應(yīng)最大的優(yōu)點(diǎn)是速度快，可在數(shù)小時內(nèi)得到結(jié)果，但也存在一些不足：只能對已知的編碼基因進(jìn)行檢測，而對目前尚未發(fā)現(xiàn)的基因型無法進(jìn)行檢測[13-14]；若細(xì)菌存在少見或未知的耐藥基因，則會導(dǎo)致碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果呈假陰性；且價格昂貴，需要特定的設(shè)備，對操作人員有一定的技術(shù)要求；后續(xù)分析如藥物敏感性試驗(yàn)仍需依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法等。

本研究采用雙濃度篩查法，先根據(jù)是否對碳青霉烯類耐藥將大部分的樣本分為陽性和陰性，不需要對每株細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)或者耐藥基因的檢測，大大減少了工作量。只對少部分在含2 μg/mL美羅培南的TSB肉湯中生長，而在4 μg/mL TSB肉湯中不生長的菌株通過mCIM確認(rèn)是否含碳青霉烯酶，方便地篩查出CRE，與儀器分析結(jié)果的符合率為98.7%，敏感性為98.1%，特異性為98.9%，適用對直腸拭子或肛拭子樣本的篩查，操作簡便，無需特殊的試劑和儀器，適合在各級醫(yī)院的微生物實(shí)驗(yàn)室中推廣使用，具有很大的應(yīng)用價值。

本研究通過CLSI推薦的eCIM對52株mCIM陽性菌株進(jìn)行碳青霉烯酶的快速分型，結(jié)果顯示，eCIM陽性菌株為13株，陽性率為25%。按照CLSI 2019版的標(biāo)準(zhǔn)給臨床報(bào)告eCIM陽性（產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶）或陰性（產(chǎn)絲氨酸酶），可為臨床用藥提供重要參考，頭孢他啶-阿維巴坦對金屬β-內(nèi)酰胺酶無活性，但是對于絲氨酸碳青霉烯酶非常有效，所以對mCIM陽性菌株再進(jìn)行eCIM非常必要，有利于臨床醫(yī)生精準(zhǔn)用藥，減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的院內(nèi)流行，對于控制感染，提高患者生存率均有重要意義。