張 壘，張 霞，翁儀瑾，劉 肖

上海工程技術(shù)大學(xué)材料工程學(xué)院，上海 201620

引 言

納米酶是一類既有納米材料的獨特性能，又有催化功能的模擬酶，具有催化效率高、穩(wěn)定、經(jīng)濟和可規(guī)模化制備的特點[1-4]。2007年Gao等[5]發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米顆粒(NPs)具有過氧化物酶催化活性后，其他很多具有模擬酶活性的納米材料相繼被發(fā)現(xiàn)，如Au NPs、CeO2NPs、Co3O4NPs和碳基納米材料等[6-7]。天然蛋白酶通常工作在各種生物基質(zhì)相關(guān)的系統(tǒng)中，限制了天然酶的應(yīng)用。與天然蛋白酶不同, 納米酶可以在水或緩沖溶液中，且表現(xiàn)出良好的催化性能，大多數(shù)納米酶包含過渡金屬原子或離子甚至不同的碳納米材料, 而這些金屬或碳納米材料的活性可能是影響納米酶催化活性的重要因素[8]。合理調(diào)節(jié)納米酶的某些外部可控因素，能夠使納米酶更接近于它的天然對應(yīng)物，甚至優(yōu)于其天然對應(yīng)物。

導(dǎo)電高分子聚合物具有優(yōu)異的導(dǎo)電性能，因此作為一種先進的材料受到人們的廣泛關(guān)注。在各種導(dǎo)電高分子聚合物中，聚苯胺PANI因其導(dǎo)電性可調(diào)、合成方便、成本低等優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]。由于具有豐富的胺和亞胺基團，聚苯胺(PANI)也被認為是無機納米粒子的理想載體，特別是由PANI和功能性無機納米顆粒組成的雜化產(chǎn)物，往往由于其協(xié)同效應(yīng)，比獨立組分表現(xiàn)出新的或更優(yōu)越的性質(zhì)。例如，研究學(xué)者將金納米顆粒作為載體直接還原沉積在預(yù)合成的PANI納米纖維表面，制備了具有納米纖維形態(tài)的Au/PANI納米復(fù)合材料[11]。

通過使用簡單方便的一步自組裝氧化還原聚合法制備了Ag/PANI納米復(fù)合材料，使用SERS作為主要的檢測手段，研究了Ag/PANI納米復(fù)合材料作為串聯(lián)酶(模擬過氧化物酶和模擬葡萄糖氧化酶)的催化性能。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

采用日立高新S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡對納米復(fù)合材料進行微觀形貌分析，并進行能譜掃描，檢測納米復(fù)合材料的成分。采用日本島津公司的紫外可見分光光度計(UV-Vis)對其進行吸光度研究。采用HORIBA集團生產(chǎn)的拉曼光譜儀(HR Evolution)對納米復(fù)合材料樣品進行SERS分析，激發(fā)光波長選擇633 nm。制備納米材料所有試劑見表1。

表1 化學(xué)試劑詳細信息Table 1 Type of chemical reagent

1.2 復(fù)合材料的制備

通過一步自組裝氧化還原聚合法制備Ag/PANI納米顆粒[12]，將10 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和4.6 mL的水分別滴入到50 mL的燒杯中，磁力攪拌5 min后，加入0.5 mL AgNO3水溶液(8.63 mg·mL-1)，繼續(xù)磁力攪拌5 min。向上述溶液中加入10 μL的苯胺單體，保持磁力攪拌反應(yīng)4 h，完成苯胺的聚合和AgNO3的還原過程。最后將得到的產(chǎn)物用水和乙醇分別洗滌2次，移除上清液后將樣品在空氣中干燥24小時，然后將干燥好的納米復(fù)合材料粉末配置成水懸浮溶液(3 mg·mL-1)。為了進行對比實驗，用同樣的方法 (0.5 mL 20 mg·mL-1HAuCl4)制備了Au/PANI納米復(fù)合材料。

1.3 酶活性研究以及SERS檢測樣品的制備

分別取30 μL醋酸緩沖溶液(pH 4.0)、10 μL的TMB原液、10 μL的H2O2(30%水溶液)或葡萄糖水溶液，7 μL納米復(fù)合材料(不同體積配比測試結(jié)果略)的水懸浮液(3 mg·mL-1)，并依此滴入離心管中(如圖1)。震蕩30 s后使用毛細管吸取樣品進行拉曼光譜的檢測。

圖1 酶活性研究中各物質(zhì)的添加順序示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 納米復(fù)合材料微觀形貌的表征

使用掃描電子顯微鏡(SEM)對納米復(fù)合材料的微觀形貌進行表征。圖2顯示了Ag/PANI在不同放大倍數(shù)下的SEM圖像，放大倍數(shù)為25×103和50×103時[如圖2(a)和(b)所示]，可以看出納米顆?；境尸F(xiàn)球型，且大小均一，分散性良好，類似蜂巢狀分布。當(dāng)放大倍數(shù)進一步增大時如圖2(c,d)所示，可以看出納米顆粒大小在50 nm左右，分布均勻，呈現(xiàn)石榴狀。相比之下Au/PANI納米復(fù)合材料顆粒較大，大多呈現(xiàn)棒狀，少量呈現(xiàn)橢圓狀，大小約在2 μm左右。此外，本文通過EDS能譜掃描進一步驗證了納米顆粒是PANI和Ag的復(fù)合材料，如圖2(e)能譜圖所示，納米顆粒是由C，N和Ag元素組成。

圖2 不同放大倍數(shù)下的Ag/PANI納米復(fù)合材料的SEM圖像以及EDS能譜(a)：25×103; (b)：50×103; (c)：100×103;(d)：200×103; (e)：Ag/PANI的EDS能譜

2.2 模擬過氧化物酶活性的研究

模擬過氧化物酶可以在H2O2存在下將顯色底物3,3’，5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)催化氧化成oxTMB，從而使溶液顏色發(fā)生變化，因此可以通過TMB的顯色反應(yīng)直觀檢測過氧化物酶的活性，其原理如圖3所示。目前大量的模擬酶活性研究以及微量檢測中最常用的是通過TMB被氧化生成oxTMB時在650 nm處的紫外吸收峰值檢測過氧化物酶的活性[13]，本文使用的Ag/PANI可以作為具有增強效果的SERS基底，因此采用毛細管吸取液體直接進行SERS檢測，通過檢測oxTMB的拉曼峰值檢測納米復(fù)合材料的模擬酶活性。相比于常見的紫外-可見吸收光譜測試納米酶活性，本文直接吸取液體進行SERS檢測，更快速、精準(zhǔn)、靈敏的拉曼特征峰，該測試技巧可以通過便攜式拉曼光譜儀隨時隨地、更加方便快捷地實現(xiàn)檢測。

圖3 納米顆粒作為過氧化物酶與H2O2反應(yīng)氧化TMB的原理示意圖

為了研究所制備的Ag/PANI的過氧化物酶活性，在實驗過程中，通過控制變量法進行了對比試驗，如表2所示，只有一定量的TMB和30%的過氧化氫，與適量的納米顆粒震蕩反應(yīng)10 s后，溶液的顏色才有明顯變化，隨后離心、取上清液加入微量比色皿中進行紫外吸收光譜測試，結(jié)果表明650 nm處有明顯的吸收峰[圖4(a)]。圖4(b)為納米復(fù)合材料作為模擬過氧化物酶在不同pH的緩沖溶液中活性的研究，在pH不同的緩沖溶液下，對反應(yīng)體系進行拉曼光譜測試(探針分子為oxTMB)，并選取1 611 cm-1處的拉曼峰值為I，緩沖溶液pH 4.0 時1 611 cm-1處的SERS強度作為標(biāo)準(zhǔn)值I0。可以看出納米復(fù)合材料在pH 4.0時，過氧化物酶活性最高(后續(xù)試驗均選取pH 4.0的緩沖溶液)。

表2 不同反應(yīng)體系的成分以及對應(yīng)的視覺照片Table 2 The components of different reaction systems and corresponding visual photographs

為了進一步檢測Ag/PANI作為過氧化物酶催化氧化TMB的活性，選取濃度更低的H2O2(10-1～10-6mol·L-1)與TMB反應(yīng)，并進行拉曼光譜測試，結(jié)果如圖5(a)所示，可以看出oxTMB的拉曼峰仍然清晰，且沒有發(fā)生光譜干擾等現(xiàn)象，通過1 189，1 334和1 611 cm-1處oxTMB的拉曼峰強度折線圖可以看出在很大范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系如圖5(b)所示，特別是1 334 cm-1處拉曼峰的強度。為了進一步驗證Ag/PANI的活性優(yōu)于Au/PANI，對兩種納米顆粒與不同濃度的H2O2進行TMB顯色反應(yīng)，并進行拉曼光譜測試，取1 611 cm-1處的拉曼峰值進行擬合。結(jié)果表明，Ag/PANI比Au/PANI具有更優(yōu)異的催化活性，這可能是由于在一步氧化還原聚合法中，金納米顆粒與PANI發(fā)生絡(luò)合作用導(dǎo)致的納米顆粒較大，從而影響了納米顆粒的催化效果。

圖4 (a)不同反應(yīng)體系的紫外-可見吸收光譜；(b)在pH 2.0～8.0下測量過氧化物酶的活性

2.3 葡萄糖酶活性的研究

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是食品工業(yè)中一種重要的工業(yè)用酶，廣泛用于食品快速檢測及生物傳感器。葡萄糖氧化酶氧化1 mol葡萄糖需要消耗1 mol氧氣并生成1 mol H2O2：C6H12O6+O2+H2O→C6H12O7+H2O2，因此，葡萄糖和葡萄糖氧化酶的催化反應(yīng)可以作為H2O2的來源，當(dāng)納米顆粒具有葡萄糖氧化酶活性時，便可以代替GOD進行葡萄糖氧化反應(yīng)(原理圖如圖6所示)。

當(dāng)納米材料同時具有葡萄糖氧化酶活性和過氧化物酶活性時，在TMB的顯色反應(yīng)中，該納米顆?？梢宰鳛榇?lián)酶，實現(xiàn)對葡萄糖的檢測[14]。在整個反應(yīng)過程中，首先作為葡萄糖氧化酶與葡萄糖反應(yīng)，生成H2O2，同時作為過氧化物酶在第一步提供了H2O2的條件下，與TMB發(fā)生顯色反應(yīng)。原理如圖7所示，其中圖7(a)部分是納米復(fù)合材料作為葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的反應(yīng)，為TMB的顯色反應(yīng)提供了H2O2，圖7(b)部分是納米顆粒作為過氧化物酶與H2O2反應(yīng)催化氧化TMB。

圖5 (a)Ag/PANI作為納米酶，添加不同濃度的H2O2氧化TMB的拉曼光譜; (b)oxTMB在1 189，1 334和1 650 cm-1的拉曼光譜強度的折線圖

圖6 納米顆粒作為葡萄糖氧化酶的原理示意圖Fig.6 Schematic diagram of nanoparticles as glucose oxidase

通過對不同pH值的緩沖溶液形成的反應(yīng)體系進行拉曼光譜測試，檢測oxTMB在1611 cm-1的峰值，并進行擬合處理，研究了反應(yīng)體系的pH值對Ag/PANI作為串聯(lián)酶活性的影響[圖8(a)]，可以看出當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為4.0時，酶活性最高。在上述最優(yōu)條件下，通過降低葡萄糖水溶液的濃度，研究了Ag/PANI作為串聯(lián)酶的酶活性，如圖8(b)所示，當(dāng)與串聯(lián)酶反應(yīng)的葡萄糖濃度低至10-10mol·L-1時依然可以進行催化氧化TMB的反應(yīng)，生成oxTMB，且拉曼信號清晰可見。

圖7 Ag/PANI在TMB顯色反應(yīng)中作為串聯(lián)酶的活性原理示意圖

圖8 (a)在pH 2.0～8.0下測量串聯(lián)酶的活性，其中I=I/I0，I為不同緩沖溶液中TMB在1 611 cm-1 的SERS強度，I0為pH 4.0的緩沖溶液中TMB在1 611 cm-1 的SERS強度；(b)Ag/PANI作為納米酶，通過添加不同濃度的葡萄糖提供H2O2氧化TMB的拉曼光譜

3 結(jié) 論

采用一步自組裝氧化還原聚合法，成功制備了具有SERS增強效果的Ag/PANI納米復(fù)合材料，研究了納米復(fù)合材料的模擬酶活性。結(jié)果表明，這種Ag/PANI納米復(fù)合材料不僅具有模擬過氧化物酶活性，還具有葡萄糖氧化酶的活性，且pH 4.0時酶活性最高。在最優(yōu)條件下，研究了納米顆粒作為串聯(lián)酶的活性，通過直接氧化葡萄糖自提供H2O2，繼而反應(yīng)氧化TMB，實現(xiàn)間接檢測葡萄糖，檢測極限可達10-10mol·L-1。在檢測方法上，與SERS技術(shù)相結(jié)合，避免了紫外-可見吸收光譜制樣中離心等步驟帶來的影響。此外，隨著便攜式拉曼光譜儀的迅速發(fā)展，SERS檢測可以在更多場合下實現(xiàn)對葡萄糖更加方便快捷、精準(zhǔn)靈敏的檢測。