徐偉良，李春冬，雅 梅，2，郭 梁，2

（1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 食品檢驗(yàn)檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000）

微生物廣泛存在于自然界中，有著極高的多樣性和豐富度，并且這些微生物并不是單獨(dú)存在的，而是共存于微生物群落中，如乳酸菌與酵母菌常共生形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)[1]。人們很早就學(xué)會(huì)利用乳酸菌與酵母菌作為益生菌用于生產(chǎn)、生活，例如，日常生活中常見的泡菜[2]、葡萄酒[3]、醋[4]、饅頭[5]及酸粥[6]等，也有如馬奶酒[7]、開菲爾[8]、干酪[9]、黃油[10]等通過天然微生物菌群生產(chǎn)的發(fā)酵乳制品。雖然乳酸菌和酵母菌之間的相互作用對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)地、風(fēng)味及生物保健功效等起著不可代替的作用[11-12]，但目前對(duì)于乳酸菌和酵母菌相互作用機(jī)理還處于推測(cè)階段，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳酸菌與酵母菌之間可能存在代謝產(chǎn)物互補(bǔ)機(jī)制，以及通過信號(hào)分子進(jìn)行信息交流，來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[13-14]。隨著對(duì)微生物代謝途徑的深入理解以及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，乳酸菌與酵母菌的相互作用機(jī)理勢(shì)將得以闡明，從而對(duì)更廣泛挖掘和利用微生物資源具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[15]。

自然發(fā)酵乳制品是指以乳（包括馬乳、牛乳、駝乳、羊乳、牦牛乳等）為原料，經(jīng)微生物自然發(fā)酵，形成的主要產(chǎn)物為乳酸的乳制產(chǎn)品[16]。我國(guó)發(fā)酵乳制品的制作歷史悠久，制作工藝源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，據(jù)記載，北方游牧民族早在2 000多年前由于游牧生活的需要，就有制作和食用自然發(fā)酵乳制品的習(xí)俗[17]。發(fā)酵乳制品利用環(huán)境中的微生物進(jìn)行自然發(fā)酵，不僅保留了乳品的天然品質(zhì)特色，而且其中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌和酵母菌資源。

本研究通過構(gòu)建自然發(fā)酵牛乳體系，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期乳酸菌和酵母菌的活菌動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，有助于深入了解自然發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌的變化規(guī)律以及相互作用，為進(jìn)一步工業(yè)化鮮制奶酪的生產(chǎn)以及富含乳酸菌和酵母菌的功能發(fā)酵乳的研發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

新鮮牛乳：每隔1 d從錫林郭勒盟溪沐力克乳品有限公司采集同一種群奶牛的三個(gè)批次新鮮牛乳（A、B、C），三個(gè)批次新鮮牛乳的感官、理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)基本一致，每批次100 kg。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：北京路橋技術(shù)股份有限公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-J-2FD凈化工作臺(tái)：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；Lactoscan LWA乳成分分析儀：杭州麥力斯科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 初始奶源質(zhì)量品質(zhì)檢測(cè)

感官指標(biāo)的測(cè)定：將100 kg新鮮牛奶經(jīng)過濾除雜后，取適量試樣置于50 mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)，聞其氣味，品嘗滋味，對(duì)其進(jìn)行色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)等感官指標(biāo)評(píng)價(jià)[18]。

理化指標(biāo)的測(cè)定：采用酸度計(jì)直接測(cè)定樣品pH值；參照國(guó)標(biāo)GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》[19]中的方法測(cè)定酸度；利用乳成分分析儀測(cè)定蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、非脂乳固體等理化指標(biāo)[20-21]。

微生物指標(biāo)的測(cè)定：參照GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[22]對(duì)初始奶源乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)；參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[23]對(duì)初始奶源酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將連續(xù)3個(gè)批次（A、B、C）均符合GB 19301—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》[18]中感官、理化要求，并且檢測(cè)的微生物指標(biāo)（乳酸菌與酵母菌）基本一致的牛乳作為后續(xù)自然發(fā)酵的原料乳。

1.3.2 自然發(fā)酵牛乳樣品的采集

將符合上述檢測(cè)指標(biāo)的新鮮牛乳倒入敞開式發(fā)酵池中，環(huán)境溫度控制在（20±1）℃條件下，自然發(fā)酵72 h，每隔8 h取樣一次，連續(xù)采集10次，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定pH值和溫度，并將樣品裝入無菌采樣袋中4 ℃低溫保存，盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌和酵母菌計(jì)數(shù)。

1.3.3 自然發(fā)酵牛乳樣品中乳酸菌和酵母菌計(jì)數(shù)

取1 mL采集的新鮮自然發(fā)酵牛乳樣品加入到含9 mL 0.85%生理鹽水的試管內(nèi)，進(jìn)行梯度稀釋，選取3個(gè)適宜的梯度，涂布于MRS培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。將MRS平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)3 d；PDA平板正置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d。參照方法1.3.1對(duì)自然發(fā)酵牛乳樣品中的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

每批次樣品的理化指標(biāo)檢測(cè)與乳酸菌和酵母菌計(jì)數(shù)結(jié)果均重復(fù)測(cè)定3次，采用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用單因素方差分析與t檢驗(yàn)方法，在α=0.05顯著水平下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始奶源質(zhì)量品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)初始新鮮牛奶的感官評(píng)價(jià)、理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)，以保證牛乳來源的質(zhì)量品質(zhì)，從而排除奶源對(duì)后續(xù)自然發(fā)酵試驗(yàn)條件的影響。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，連續(xù)三個(gè)批次的新鮮牛乳色澤均為乳白色，有固有的乳香味，無異味，組織狀態(tài)均勻一致，無凝塊及沉淀。故三個(gè)批次的牛乳感官評(píng)價(jià)相一致，符合奶源一致性要求。其理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1，微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2。

表1 初始奶源理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of initial milk

表2 初始奶源微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of microbial indexes of initial milk

由表2可知，三個(gè)批次初始牛乳樣品（A、B、C）的pH值、酸度、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂乳固體含量均無顯著差異（P＞0.05），C批次初始牛乳脂肪含量顯著高于A與B批次（P＜0.05），而A批次與B批次牛乳脂肪含量差異不顯著（P＞0.05）。其中脂肪、蛋白質(zhì)及非脂乳固體含量均符合GB 19301—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生乳》[18]（脂肪≥3.1%，蛋白質(zhì)≥2.8%，非脂乳固體≥8.1%）中要求。由于pH值和酸度能夠間接反映牛乳的發(fā)酵程度，因此，對(duì)于初始奶源中pH值和酸度的檢測(cè)對(duì)描述初始牛乳發(fā)酵程度具重要意義。連續(xù)三批次初始牛乳樣品（A、B、C）的pH值和酸度均無顯著差異（P＞0.05），從而推測(cè)奶源處于同一初始發(fā)酵程度。

由表2可知，三個(gè)批次初始牛乳樣品（A、B、C）中乳酸菌活菌數(shù)經(jīng)無顯著差異（P＞0.05）；而對(duì)于酵母菌活菌數(shù)，A批次初始牛乳顯著高于B與C批次（P＜0.05），而B批次與C批次牛乳差異不顯著（P＞0.05），這可能與三批次初始牛乳樣品來自同一個(gè)牧場(chǎng)的奶源有關(guān)。由此可知，三批次初始牛乳間的乳酸菌數(shù)和酵母菌整體波動(dòng)范圍較小，可作為三次獨(dú)立材料用于后續(xù)自然發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 自然發(fā)酵牛乳溫度與pH變化情況

2.2.1 自然發(fā)酵牛乳溫度的變化

傳統(tǒng)發(fā)酵牛乳的制作工藝是將新鮮牛奶不經(jīng)過殺菌處理，直接過濾除雜后放入干凈容器中，靜置在蒙古包或室內(nèi)的陰涼處自然發(fā)酵，發(fā)酵溫度在20 ℃左右，發(fā)酵時(shí)間為夏季1～2 d，冬季3～4 d[24-25]。在自然發(fā)酵的后期，乳脂會(huì)隨著發(fā)酵環(huán)境的變化富集在表層形成白色稠狀物質(zhì)，即為奶嚼口（民族傳統(tǒng)乳制品），而酪蛋白經(jīng)蛋白酶水解與水形成下層凝乳[26-27]。本實(shí)驗(yàn)利用空調(diào)設(shè)備將外部環(huán)境溫度維持在（20±1）℃，通過對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期樣品的發(fā)酵溫度進(jìn)行測(cè)定，來監(jiān)控溫度對(duì)其發(fā)酵情況的影響，其結(jié)果見圖1。

圖1 自然發(fā)酵牛乳發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度的變化Fig.1 Changes of fermentation temperature during naturally fermented milk fermentation process

由圖1可知，三個(gè)批次牛奶樣品的初始溫度平均值為（8.03±1.31）℃，隨后樣品的溫度逐漸上升并基本維持在16 ℃左右，其中上層奶嚼口和下層凝乳樣品的溫度變化基本一致。因此，推斷模擬牛乳自然發(fā)酵狀態(tài)下，環(huán)境溫度基本保持在同一波動(dòng)幅度，對(duì)發(fā)酵牛乳中微生物的生長(zhǎng)變化影響較小。

2.2.2 自然發(fā)酵牛乳pH值的變化

pH值對(duì)微生物的生命活動(dòng)有很大的影響，而微生物對(duì)pH條件的不同要求在一定程度上反映出微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛乳不同發(fā)酵時(shí)間階段牛乳的pH值進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2 自然發(fā)酵牛乳發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH during naturally fermented milk fermentation process

由圖2可知，三批次牛奶樣品發(fā)酵過程中pH值的變化趨勢(shì)基本一致，在發(fā)酵前32 h時(shí)，pH值下降不明顯，平均pH值只降低了0.29±0.085，隨后pH值呈快速下降趨勢(shì)，當(dāng)pH值下降至5左右時(shí)，發(fā)酵牛乳開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象，乳脂不斷上浮形成上層的奶嚼口，而下層乳基隨著pH值不斷下降，當(dāng)pH值下降至4.6左右時(shí)，逐漸形成下層凝乳。并且奶嚼口在不同發(fā)酵階段的pH值明顯低于下層凝乳，因此，推測(cè)奶嚼口和下層凝乳中微生物生長(zhǎng)變化存在一定的差異，具體還需對(duì)乳酸菌與酵母菌的計(jì)數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

通過上述三批次自然發(fā)酵牛乳中pH值變化均呈先緩慢下降后快速下降的趨勢(shì)，推測(cè)這與發(fā)酵牛乳酸凝乳過程有關(guān)。牛乳中酪蛋白常以酪蛋白-磷酸鈣復(fù)合體形式存在于牛乳溶膠中，酸凝乳方式則是利用乳酸菌發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)酸或添加食用酸使原乳pH值下降從而誘導(dǎo)酪蛋白膠束聚集，逐漸形成凝乳[28]。通過對(duì)發(fā)酵牛乳中溫度及pH值變化的研究表明，在（20±1）℃的自然發(fā)酵溫度下，持續(xù)發(fā)酵56 h后，發(fā)酵牛乳的pH值下降至pH 4.6～5.0時(shí)，發(fā)酵牛乳會(huì)出現(xiàn)分層并形成上層奶嚼口和下層凝乳。

2.3 自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的動(dòng)態(tài)變化

一般微生物的生長(zhǎng)繁殖有一定規(guī)律性，典型的可分為延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段[29]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同發(fā)酵階段的乳酸菌和酵母菌分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用以研究自然發(fā)酵牛乳中微生物的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果見圖3。

圖3 自然發(fā)酵牛乳發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌數(shù)的變化Fig.3 Change of lactic acid bacteria and yeast counts during naturally fermented milk fermentation process

由圖3可知，綜合評(píng)價(jià)三批次自然發(fā)酵牛乳發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌的活菌動(dòng)態(tài)變化后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)與微生物生長(zhǎng)所具有的延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期三個(gè)典型階段相類似。在生長(zhǎng)初期有近16 h的緩慢生長(zhǎng)階段，隨后進(jìn)入快速增長(zhǎng)階段，乳酸菌數(shù)不斷增加。酵母菌的生長(zhǎng)與乳酸菌相比，并沒有出現(xiàn)明顯的快速增長(zhǎng)階段，在生長(zhǎng)初期呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)，在發(fā)酵24～32 h時(shí)達(dá)到第一次生長(zhǎng)峰值，隨即生長(zhǎng)逐漸下降，而此時(shí)乳酸菌正處于快速生長(zhǎng)階段。因此，推測(cè)在乳酸菌處于快速增長(zhǎng)階段時(shí)，酵母菌呈先增高后下降的現(xiàn)象可能是由于自然發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌在開始表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系，隨著乳酸菌的快速生長(zhǎng)而抑制酵母的增多。例如有研究者報(bào)道乳酸菌和酵母菌混合培養(yǎng)的抑制作用表現(xiàn)在乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如苯乳酸、4-羥基-苯乳酸、環(huán)肽類物質(zhì)抑制了酵母菌的生長(zhǎng)[30]。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)發(fā)酵牛乳出現(xiàn)分層現(xiàn)象后，上層奶嚼口和下層凝乳中的乳酸菌和酵母菌的生長(zhǎng)又呈現(xiàn)不同的變化。三個(gè)批次奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)見表3。

由表3可知，在發(fā)酵牛乳分層后的56 h、64 h、72 h三個(gè)發(fā)酵階段，上層奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌的平均活菌數(shù)分別為（12.02±1.21）lg（CFU/mL）、（11.54±1.30）lg（CFU/mL），兩者間兩者間沒有顯著差別（P＞0.05）；而上層奶嚼口和下層凝乳中酵母菌平均活菌數(shù)分別為（6.39±0.60）lg（CFU/mL）、（4.56±0.30）lg（CFU/mL），上層奶嚼口顯著高于下層凝乳中的酵母菌平均活菌數(shù)（P＜0.05）。此結(jié)果恰能說明由圖2中奶嚼口的pH值明顯低于下層凝乳推測(cè)奶嚼口和下層凝乳中微生物生長(zhǎng)變化存在一定的差異的假設(shè)。對(duì)于上層奶嚼口中酵母菌數(shù)量增加的情況推測(cè)可能原因是上層奶嚼口暴露在空氣中形成了高脂和高溶氧的環(huán)境促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)。如有學(xué)者認(rèn)為酵母菌對(duì)脂肪酸的水解能力較強(qiáng)，并且分解脂肪產(chǎn)生出的游離脂肪酸可能會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)[31]。

乳品的自然發(fā)酵過程非常復(fù)雜，涉及微生物和生化變化。FOX P F等[32]研究奶酪的成熟過程發(fā)現(xiàn)，微生物的成熟包括初始發(fā)酵細(xì)菌的死亡和自溶，不定菌群（非發(fā)酵乳酸菌）的生長(zhǎng)和繼發(fā)微生物群生長(zhǎng)。在奶酪成熟過程中，首先是起始細(xì)菌快速繁殖，在奶酪菌群中占主導(dǎo)地位，但大多數(shù)細(xì)菌都會(huì)很快死亡和裂解，并釋放肽酶等多種細(xì)胞內(nèi)酶，與凝乳酶一起將酪蛋白水解為肽和氨基酸，為后續(xù)菌群的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而非發(fā)酵乳酸菌多為異發(fā)酵乳桿菌和專一性異源發(fā)酵乳桿菌，繼發(fā)微生物群多涉及短桿菌、微球菌、酵母菌和霉菌等，它們常常一起參與奶酪的成熟過程。因此，自然發(fā)酵牛乳微生物的生長(zhǎng)中不僅受群落內(nèi)部物種間交互作用的影響，還受到環(huán)境和空間因素對(duì)多樣性的影響，整體處于動(dòng)態(tài)變化的過程。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的活菌動(dòng)態(tài)變化分析表明，在（20±1）℃的自然發(fā)酵溫度下，持續(xù)發(fā)酵56 h后，pH值下降至4.6～5.0范圍時(shí)，自然發(fā)酵牛乳出現(xiàn)分層并形成上層奶嚼口和下層凝乳；其中奶嚼口和凝乳中乳酸菌的活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），而凝乳中酵母菌活菌數(shù)顯著低于奶嚼口（P＜0.05）。乳酸菌的生長(zhǎng)具有延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期三個(gè)典型階段，酵母菌并沒有典型的對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)；在自然發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌開始表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系，隨著乳酸菌的生長(zhǎng)反而抑制酵母菌的增多。通過模擬自然狀態(tài)下牛乳的發(fā)酵條件，初步分析了乳酸菌和酵母菌的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)變化和相互作用，將有助于為下一步富含乳酸菌和酵母菌的功能發(fā)酵乳的研發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。