譚蘭蘭，朱小芳，李 坤，胡小冬，陳世彪

(1.南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2017級; b.第一附屬醫(yī)院麻醉科,南昌330006；2.新余市人民醫(yī)院麻醉科； 3.新余市礦業(yè)醫(yī)院麻醉科,江西 新余 338000)

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(PND)是老年患者圍術(shù)期最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥之一。短期內(nèi)多次經(jīng)歷麻醉手術(shù)，如燒傷、整容及需通過多次外科手術(shù)治療的患者。七氟烷為臨床上當(dāng)前常用的吸入麻醉藥，而短期內(nèi)多次行七氟烷吸入麻醉可以誘發(fā)老齡大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙[1-2]。白藜蘆醇是一種普遍存在于葡萄等自然界植物中具有生物活性的天然物質(zhì)，其可通過抗炎、抗氧化能力及抗凋亡效用起到一定的神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)功能[3]。體外試驗(yàn)[4]顯示，白藜蘆醇可以改善七氟烷麻醉誘發(fā)的神經(jīng)元損傷；在體研究[5]證明，白藜蘆醇可以改善異氟烷麻醉誘發(fā)的老齡小鼠中樞神經(jīng)認(rèn)知障礙。本研究擬評估白藜蘆醇預(yù)處理對老齡大鼠短期多次七氟烷麻醉誘發(fā)神經(jīng)認(rèn)知障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇購自于西安Oasis生物技術(shù)工程有限公司(批號：20040801，純度≥98%)，七氟醚購自于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司(批號：H20070172)，1%羥甲基纖維素鈉購自于湘潭嘉葉源生物有限公司，麻醉氣體監(jiān)測機(jī)器購自于美國Ohmeda-Detax公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

本實(shí)驗(yàn)在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷研究所完成。健康清潔級老齡雄性SD大鼠60只，體重310～460 g，月齡18個月，購自于南昌大學(xué)動科部。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為對照組(C組，n=20)、七氟烷組(S組，n=20)和白藜蘆醇預(yù)處理組(R組，n=20)。

1.3 麻醉模型的建立及給藥

參照文獻(xiàn)[2]，建立老齡大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉模型。將老齡大鼠安置于密閉麻醉實(shí)驗(yàn)箱中，麻醉實(shí)驗(yàn)箱兩端分別開有一小圓孔，一孔連接麻醉機(jī)，輸入氧氣2.5 L·min-1及氮?dú)? L·min-1。另一孔為排氣端，且接S/5型麻醉氣體監(jiān)測機(jī)器(Ohmeda-Detax公司，美國)監(jiān)測七氟烷、氮?dú)饧岸趸紳舛?。麻醉?shí)驗(yàn)箱底部置于37 ℃的恒溫水浴實(shí)驗(yàn)箱中。先予3組不同的預(yù)處理方式，R組在首次吸入七氟烷氣體前連續(xù)7 d每天經(jīng)口灌胃1%羥甲基纖維素鈉溶液制備的白藜蘆醇混懸液40 mg·kg-1·d-1；S組于首次吸入七氟烷氣體前連續(xù)7 d每天經(jīng)口灌胃等容量的1%羥甲基纖維素鈉溶液40 mg·kg-1·d-1；C組在首次吸入空氣前連續(xù)7 d每天經(jīng)口灌胃等容量的1%羥甲基纖維素鈉溶液40 mg·kg-1·d-1。預(yù)處理結(jié)束后R和S組均吸入3%七氟醚氣體，C組僅吸入空氣，100 min·d-1，連續(xù)吸入5 d。

1.4 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

末次吸入結(jié)束后每組隨機(jī)選取10只麻醉狀態(tài)下老齡大鼠，剝離顱內(nèi)雙側(cè)海馬組織，稱重后，按體重與體積比加入4 ℃生理鹽水制備成10%的組織勻漿液，低溫下2500 r·min-1，離心10 min，離心半徑13.5 cm，選取上清液，4 ℃低溫保存下待測。測定其中超氧化物岐化酶(SOD)活性、微量丙二醛(MDA)含量和IL-1β含量。

1.5 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

末次吸入氣體結(jié)束后24 h 3組取剩下的10只老齡大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[6]測試其認(rèn)知功能。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)步驟：水迷宮裝置為一直徑150 cm，高50 cm的開口圓桶，桶內(nèi)裝水，水溫20～24 ℃，水深40 cm。該水迷宮分設(shè)4個象限，將一直徑10 cm的平臺隱藏放置于一象限水面下方2 cm處。將老齡大鼠各自從各個象限面朝池壁緩慢放入水中，記錄大鼠從放入水中到爬上隱藏平臺所需時間(即為逃避潛伏期)。如果120 s大鼠未能找到平臺，用導(dǎo)向桿引導(dǎo)大鼠至隱藏平臺上，逃避潛伏期則記為120 s。每天重復(fù)訓(xùn)練4次，連續(xù)進(jìn)行訓(xùn)練4 d。探索實(shí)驗(yàn)步驟：第5天時將隱藏平臺拆除，從原平臺放置的對角方向?qū)⒗淆g大鼠面朝池壁緩慢放入水中，記錄其60 s內(nèi)其在原放置隱藏平臺位置停留時間，反復(fù)進(jìn)行4次，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與C組比較，S組七氟烷吸入麻醉結(jié)束后第1—4 d逃避潛伏期明顯延長，原隱藏平臺位置停留時間明顯縮短(P<0.05)，R組逃避潛伏期和原隱藏平臺位置停留時間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與S組比較，R組第1～4 d逃避潛伏期明顯縮短，原隱藏平臺位置停留時間明顯延長(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 海馬SOD活性、IL-1β和MDA含量的比較

與C組比較，S組七氟烷吸入麻醉結(jié)束后即刻海馬SOD活性明顯下降，MDA含量和IL-1β含量明顯升高(P<0.05)，R組海馬SOD活性、MDA含量和IL-1β含量差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與S組比較，R組老齡大鼠海馬SOD活性明顯升高、MDA含量和IL-1β含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠海馬SOD活性、IL-1β和MDA含量的比較

3 討論

老年因素是致使圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙的最重要因素之一[7]。月齡為18個月的大鼠相當(dāng)于大于65歲的老年人，因此本研究選取18個月大鼠作為本實(shí)驗(yàn)動物，并依據(jù)文獻(xiàn)[2]采取循環(huán)密閉式麻醉實(shí)驗(yàn)箱方法制備老齡大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉模型，本實(shí)驗(yàn)成功制備短期多次七氟烷麻醉誘發(fā)的老齡大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙模型。

有研究[8]表明，短期多次吸入3%七氟烷可誘發(fā)老齡大鼠圍術(shù)期內(nèi)神經(jīng)認(rèn)知障礙，本實(shí)驗(yàn)采取吸入3%濃度七氟烷氣體，100 min·d-1，連續(xù)吸入5 d。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方式被認(rèn)為是研究嚙齒動物空間學(xué)習(xí)及記憶功能的經(jīng)典方法，常被廣泛用于測試大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力，該實(shí)驗(yàn)所獲得的逃避潛伏期時間及反復(fù)跨越平臺次數(shù)兩個指標(biāo)，不僅可以客觀地反映動物的空間認(rèn)知能力，而且還可有效評估某些藥物干預(yù)后對該實(shí)驗(yàn)動物學(xué)習(xí)記憶能力的動態(tài)變化[9]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)文獻(xiàn)[4]采用該實(shí)驗(yàn)方式測試大鼠麻醉后的認(rèn)知功能，結(jié)果顯示，與C組比較，S組大鼠短期多次七氟烷吸入麻醉后其逃避潛伏期延長、原隱藏平臺放置位置停留時間明顯縮短(P<0.05)；多起多次吸入七氟烷可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)認(rèn)知損害的發(fā)生，而由白藜蘆醇預(yù)處理之后可以有效改善大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙。

中樞性炎性因子表達(dá)的增多與認(rèn)知功能的損害密切相關(guān)，IL-1β是被重點(diǎn)關(guān)注的促炎細(xì)胞因子，它不僅能夠減少海馬神經(jīng)元生長來源，其升高還能夠增加神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生[10]。CAO等[11]研究顯示，在神經(jīng)認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)會被大范圍激活，海馬內(nèi)固有的星型膠質(zhì)細(xì)胞活化，最終促使促炎因子IL-1β表達(dá)上調(diào)。而本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與此觀點(diǎn)類似，提示短期多次七氟烷吸入麻醉后誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙發(fā)生與炎癥因子產(chǎn)生高度相關(guān)。

SOD作為一種活性物質(zhì)，可以清除自由基等有害產(chǎn)物，使大腦免遭氧化應(yīng)激造成的損傷，起到一定的腦保護(hù)作用，是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)天然存在的抗氧化劑，也是實(shí)驗(yàn)中常用來代表機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后的主要代謝性產(chǎn)物，其含量對氧化應(yīng)激的動態(tài)變化較為敏感，能很好地反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷造成的嚴(yán)重程度[12]。本研究結(jié)果顯示，短期多次七氟烷吸入麻醉可使大鼠體內(nèi)氧自由基清除能力減弱，降低其抗氧化能力，造成體內(nèi)氧化自由基堆積，而白藜蘆醇預(yù)處理可以有效改善這些損害。

以往臨床研究[13]證明，七氟烷吸入復(fù)合麻醉圍術(shù)期，老年患者的認(rèn)知功能出現(xiàn)短期障礙。燒傷及創(chuàng)傷外科老年患者常需進(jìn)行短期多次手術(shù)和麻醉，短期多次七氟烷麻醉對老年患者的認(rèn)知損害程度可能更甚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，短期多次吸入七氟烷可誘使老齡大鼠短期神經(jīng)認(rèn)知障礙，但與C組比較，R組大鼠逃避潛伏期時間、原隱藏平臺位置停留時間、海馬IL-1β含量、SOD活性和MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示白藜蘆醇預(yù)處理可改善甚至逆轉(zhuǎn)老齡大鼠短期多次七氟烷麻醉造成的神經(jīng)認(rèn)知障礙。林茂等[14]學(xué)者證實(shí),白藜蘆醇能較好地改善阿爾茨海默癥小鼠認(rèn)知功能損害。本實(shí)驗(yàn)對象是七氟烷麻醉后大鼠，也得出類似結(jié)果，均提示白藜蘆醇具有改善神經(jīng)認(rèn)知損害的作用。

綜上所述，白藜蘆醇預(yù)處理可以改善短期多次七氟烷吸入麻醉致老齡大鼠神經(jīng)認(rèn)知障礙，其機(jī)制可能與白藜蘆醇改善大鼠顱腦組織抗氧化效能及抑制海馬炎性瀑布反應(yīng)有關(guān)。