高 奇王海燕周 偉呂寶興李玉琴

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，山東泰安 271016；2.泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東泰安 271099

復(fù)方丹參片由丹參、三七和冰片三種中藥成分構(gòu)成，具有疏通血脈、祛除瘀血、順氣止痛的功效，在冠心病、胸悶及心前區(qū)刺痛等疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用［1］。丹參作為該方君藥，其有效物質(zhì)包括脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類活性成分，這些物質(zhì)均具有活血化瘀、改善心臟功能等作用［2］，2020版《中國藥典》（一部）復(fù)方丹參片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下以丹參酮ⅡA 為指標(biāo)控制其丹參酮類成分的含量。丹參中的二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 等丹參酮類成分受品種、產(chǎn)地、栽培、采收和加工等因素的影響，研究表明陜西、山東、四川等產(chǎn)地的丹參中丹參酮類成分的含量高于安徽、河北、湖北等產(chǎn)地［3-4］。2020版《中國藥典》（一部）中復(fù)方丹參片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定，丹參以乙醇為溶劑回流提取、濃縮后，與三七粉、冰片粉及輔料混勻后制得［5］，而丹參的提取時(shí)間和溫度、真空度等生產(chǎn)工藝對(duì)丹參酮類成分影響較大。調(diào)查研究顯示，全國有700多家企業(yè)生產(chǎn)復(fù)方丹參片，但不同廠家之間復(fù)方丹參片的有效成分含量差異較大［6-8］。因此，本實(shí)驗(yàn)以丹參酮ⅡA為內(nèi)參物，采用一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）測(cè)定了10個(gè)不同生成廠家復(fù)方丹參片中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA成分的含量，以便了解不同廠家4 種丹參酮類成分含量的差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器

230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀及LC-2030 型高效液相色譜儀（日本島津）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 型高精度電子天平（日本島津）。

1.2 色譜柱

Thermo ODS-2 HYPERSIL、ICHROM C18、Agilent ZORBAX SB-C18規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5μm。

1.3 試劑和藥品

二氫丹參酮Ⅰ（批號(hào)180109，含量＞98%），隱丹參酮（批號(hào)171024，含量＞98%），丹參酮Ⅰ（批號(hào)170926，含量＞98%），丹參酮ⅡA（批號(hào)171106，含量＞98%）對(duì)照品購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；甲醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；復(fù)方丹參片均為薄膜衣小片（0.32 g/片），生產(chǎn)廠家和批號(hào)為：廠家1，批號(hào)ZBC1810；廠家2，批號(hào)201905033；廠家3，批號(hào)180309；廠家4，批號(hào)3181019；廠家5，批號(hào)190319；廠家6，批號(hào)190508；廠家7，批號(hào)17120615；廠 家8，批 號(hào)20190102；廠 家9，批 號(hào)B19A026；廠家10，批號(hào)18112201。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取二氫丹參酮對(duì)照品10 mg置于250 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。再分別精密稱取隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對(duì)照品5 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用40μg/mL的二氫丹參酮對(duì)照品溶液適量溶解，并定容至刻度，制得二氫丹參酮濃度為40μg/mL、其他三種成分濃度均為200μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所有的對(duì)照品工作液臨用前均用0.22μm膜過濾，收集續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。

2.1.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方丹參片10 片，稱量總重，研成細(xì)粉，精密稱取細(xì)粉約200 mg，置于10 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲提取，定容后用0.45μm濾膜濾過，收集續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2.2.1 色譜條件 色譜柱Ichrom C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），流速1.0 mL/min；室溫；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇將其稀釋成一系列不同濃度的混合對(duì)照品工作液（其中二氫丹參酮的濃度為2、4、8、12、16、20 μg/mL；其他3 種成分濃度為10、20、40、60、80、100μg/mL）。按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣，并以濃度（c）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析（見表1）。結(jié)果表明，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，這4種成分的線性范圍良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取云南白藥集團(tuán)的復(fù)方丹參片細(xì)粉按“2.1.2”方法制成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣，得4種成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分 別 為3.00%、3.00%、2.00%、3.00%。結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.4 重復(fù)性考察 精密稱取6 份云南白藥集團(tuán)股份有限公司的復(fù)方丹參片粉末200 mg，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定這4 種丹參酮類成分的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 4種成分的RSD分別為0.74%，1.23%，1.48%，1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 精密度考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定4種丹參酮類成分的峰面積，并計(jì)算RSD。計(jì)算得二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 分別為1.17%、1.27%、1.75%、1.00%，說明本法精密度良好。

2.2.6 加樣回收率 精密稱取6 份云南白藥集團(tuán)股份有限公司的復(fù)方丹參片細(xì)粉200 mg，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液。精密量取該樣品溶液和混合對(duì)照品溶液各1 mL 置于同一容量瓶中，得6 份混合溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)4 種藥效成分的峰面積并計(jì)算回收率及RSD值（表2）。結(jié)果表明，回收率良好，本法準(zhǔn)確度較高。

表2 二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA加樣回收率結(jié)果

2.3 樣品含量測(cè)定

將“2.1.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，得到4 種成分的峰面積并計(jì)算其含量，結(jié)果見表3。

表3 10個(gè)廠家樣品中4種丹參酮類成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.4 QAMS法

2.4.1 相對(duì)校正因子測(cè)定 以丹參酮ⅡA（d）為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算二氫丹參酮（a）、隱丹參酮（b）、丹參酮Ⅰ（c）的相對(duì)校正因子，在不同進(jìn)樣體積下的測(cè)定。結(jié)果見表4。

表4 不同進(jìn)樣體積下相對(duì)校正因子的結(jié)果

2.4.2 QAMS 法耐用性考察 考察使用島津LC-20AT、島津LC-2030 和Elite 高效液相色譜系統(tǒng)，以 及 使 用Thermo ODS-2 HYPERSIL、Ichrom C18、Agilent ZORBAXSB-C1 3 種不同廠家色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，4 種待測(cè)成分在不同色譜柱和不同儀器上的相對(duì)校正因子，見表5。結(jié)果表明相對(duì)校正因子在不同高效液相色譜儀及色譜柱下的重現(xiàn)性良好。

2.4.3 QAMS 法待測(cè)組分色譜峰的定位 為了在僅采用丹參酮ⅡA 為對(duì)照品時(shí)，能夠通過獲得的相對(duì)校正因子同時(shí)計(jì)算3 種成分的量，達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的，本研究考察了使用不同儀器和不同色譜柱時(shí)丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA 的相對(duì)保留時(shí)間，以觀察待測(cè)成分色譜峰在色譜圖上定位的準(zhǔn)確性，見表6。丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA相對(duì)保留時(shí)間的RSD分別為3.00%、1.28%、4.38%，表明相對(duì)保留時(shí)間可作為目標(biāo)峰的定位參數(shù)。因此，通過丹參酮ⅡA 的保留時(shí)間，再根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，就可以判斷出目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置。

表6 相對(duì)保留時(shí)間考察結(jié)果

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)對(duì)外標(biāo)法和QAMS 法結(jié)果進(jìn)行比較，采用單因素方差分析對(duì)10個(gè)廠家的復(fù)方丹參片進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2.6 外標(biāo)法與QAMS法測(cè)定結(jié)果的比較

分別通過外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算所有廠家復(fù)方丹參片中4種丹參酮類成分的含量，結(jié)果見表7。對(duì)兩種方法所得的4種成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，二氫丹參酮的P值為0.828，丹參酮Ⅰ的P值為0.847，隱丹參酮的P值為0.738，表明兩種方法所得的含量測(cè)定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法對(duì)10個(gè)廠家復(fù)方丹參片中待測(cè)成分的測(cè)定結(jié)果比較

2.7 不同廠家復(fù)方丹參片的組間方差分析

對(duì)10個(gè)廠家復(fù)方丹參片中的二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 的含量分別進(jìn)行組間方差分析，二氫丹參酮的P值為0.000 02，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹參酮Ⅰ的P值為0.006，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的P值為0.011，不同廠家的4種成分含量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

3.1 相對(duì)校正因子結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)證明在不同色譜柱、不同儀器等條件下，以丹參酮ⅡA 為內(nèi)參物，相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好（RSD為2.29%～4.01%），又考察了使用不同儀器和不同色譜柱時(shí)丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA的相對(duì)保留時(shí)間，可以判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置（RSD為1.28%～4.38%）。對(duì)外標(biāo)法和QAMS 法所得的4 種有效成分含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)（P＞0.05），說明相對(duì)校正因子可用于計(jì)算復(fù)方丹參片中丹參酮類活性成分的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.2 不同廠家復(fù)方丹參片有效成分的含量對(duì)比分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10個(gè)不同廠家復(fù)方丹參片中4種有效成分的含量進(jìn)行比較。復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA等成分的含量符合2020版《中國藥典》（一部）的規(guī)定，但不同廠家的復(fù)方丹參片有效成分的含量波動(dòng)范圍較大，其中二氫丹參酮的含量0.034～0.083 mg/片，隱丹參酮的含量0.118～0.381 mg/片，丹參酮Ⅰ的含量0.082～0.217 mg/片，丹參酮ⅡA 的含量0.221～0.427 mg/片，各有效成分的高低值相差2倍以上?？紤]其原因可能是復(fù)方丹參片的原料和生產(chǎn)工藝的差別，不同產(chǎn)地的丹參生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致丹參中的藥效成分含量差異較大，如產(chǎn)地為陜西的復(fù)方丹參片中丹參酮類成分較高，主要是由于陜西氣候、水分、光照等環(huán)境因素更適合丹參的生長(zhǎng)［9-11］。丹參酮類成分熱穩(wěn)定性差、見光易分解，應(yīng)在陰涼干燥（40 ℃～60 ℃）的條件下加工丹參藥材［12-13］。在丹參提取液濃縮成膏時(shí)，可引入冷凍干燥等新工藝減少溫度、光等因素對(duì)有效成分的破壞［14-15］。復(fù)方丹參片的臨床療效與內(nèi)在質(zhì)量有著密切關(guān)系，因此在生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度、真空度、時(shí)間等參數(shù)，以保證質(zhì)量一致性，提高臨床療效。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突