張亞柯 黃玉嬌 李 英 崔 瀟 楊玉嬌 李 軍

(聊城大學 藥學院，山東 聊城 252059)

0 引言

免疫脂質(zhì)體制劑作為靶向制劑的一種，具有精確靶向性、生物相容性好、毒性低、降低給藥劑量、避免耐藥性[1]和提高病人用藥順應性等優(yōu)點[2,3].CD20在95%以上的B淋巴細胞型的非霍奇金淋巴瘤中特異性高表達[4,5].羅氏公司研發(fā)的抗CD20單克隆抗體藥物美羅華(Rituximab，利妥昔單抗)上市以來，已經(jīng)有多款以CD20為靶點的單克隆抗體藥物在全球范圍內(nèi)上市或者處于研發(fā)管線[6]，用于復發(fā)的或化療抵抗性非霍奇金淋巴瘤[7,8].長春新堿作為常規(guī)聯(lián)合化療用藥，在臨床上廣泛用于非霍奇金淋巴瘤等癌癥治療[9,10].然而，由于長春新堿對腫瘤細胞和正常體細胞具有非特異性殺傷作用[11]，臨床上會引起周圍神經(jīng)病(peripheral neuropathy)、低鈉血癥(Hyponatremia)等毒副作用[12].我們制備了長春新堿脂質(zhì)體，并通過anti-CD20單克隆抗體免疫化修飾獲得了包裹長春新堿的免疫靶向脂質(zhì)體制劑[13]，一系列體外實驗證實該制劑可以特異性靶向殺傷B細胞淋巴瘤細胞[14].

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

Raji和Ramos細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC));細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清(Thermo Fisher Scientific-GIBCO公司，美國)；鞘磷脂、DSPE-PEG、Mal-PEG2000-DSPE(Avanti，美國)；膽固醇(Sigma公司)；50、100、200 nm孔徑聚碳酸酯膜(Whatman公司)；anti-CD20單克隆抗體(上海張江生物技術(shù)有限公司)；氯仿、無水乙醇等試劑(J.T.Baker公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(DOJINDO公司，日本)；硫酸長春新堿(Vincr istine，VCR)(大連美侖生物公司，中國)；Zeta電位儀Zetasizer Nano ZS(Malvern公司，英國)；脂質(zhì)體擠出器LF-1(Avestin公司，美國)；托利多XP6百萬分之一超微量天平(梅特勒，德國).

1.2 脂質(zhì)體(LP)的制備—薄膜水化法

使用超微量天平，精密稱量39 mg鞘磷脂、15 mg膽固醇、12 mg DSPE-PEG、2 mg Mal-PEG2000-DSPE于250 mL茄型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，溶于8 mL氯仿.37 ℃抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45-60 min至薄膜形成，高純氮氣吹盡殘留氯仿.加入6 mL 0.3 mol/L pH 4.0的檸檬酸溶液，順時針震搖旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，把脂質(zhì)薄膜從瓶壁上洗下來，得到半透明的脂質(zhì)乳濁液.待水合完后，超聲1分鐘，使用脂質(zhì)體擠出器，使其依次通過200、100、50 nm孔徑聚碳酸酯膜，每種膜擠過10-20次，得到粒徑均一的空白脂質(zhì)體約5.5 mL.用截留分子量為1000的透析袋在0.3 mol/L檸檬酸溶液 (pH 4.0) 1 L透析6-8 h/次重復2次.每39 mg鞘磷脂加入0.4 mg CFPE [(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (ammoniumsalt) ]，利用上述制備方法制備熒光標記的脂質(zhì)體Lip，隨后進行Anti-CD20 Fab’免疫化修飾獲得免疫化熒光脂質(zhì)體Clip和BSA修飾免疫熒光脂質(zhì)體Nlip，免疫化和BSA修飾方法如下所述[15].

1.3 長春新堿脂質(zhì)體(LPV，Liposome-Vincristine)制備—pH值梯度法

取透析后的脂質(zhì)體溶液0.2 mL，1 mg/mL長春新堿溶液0.5 mL，加入0.6 mL 1 mol/L Na2HPO4溶液中；將溶液pH值調(diào)至7.0，再加水補至2 mL體積，50 ℃水浴孵育10 min.取脂質(zhì)體溶液加入到截留分子量為1000的透析袋中，置于1 L PBS溶液透析，6-8 h/次，共兩次.

1.4 Anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質(zhì)體(CLPV)制備

Anti-CD20 Fab’巰基化，Anti-CD20 Fab’與2-IT(2-Iminothiolane.HCL，蛋白巰基化試劑)，按1:200的摩爾比例混合，室溫下輕柔搖擺反應2 h，混勻樣品.使用分子量1000透析袋，在1 L含5 mM EDTA的預冷PBS透析液中，透析去除未反應的2-IT，低速輕柔磁力攪拌，4 ℃，6-8 h，中間換液兩次.通過BCA法測蛋白濃度和Ellman法測巰基濃度共同計算抗體片段的巰基化程度.使用Stewart分析法測定LPV脂質(zhì)度，計算出Mal-PEG2000-DSPE濃度.按Mal-PEG2000-DSPE：Anti-CD20 Fab’摩爾比為1:10吸取LPV和巰基化的Anti-CD20 Fab’混勻，于16 ℃孵育過夜.使用分子量100000的透析袋去除游離的Anti-CD20 Fab’，PBS透析6 h，每2 h換一次液.

1.5 BSA修飾長春新堿脂質(zhì)體(NCLPV)對照脂質(zhì)體制備

制備方法與CLPV的制備流程相同，只是用BSA(牛血清白蛋白)替代Anti-CD20 Fab’，其他條件不變.

1.6 粒徑測定

使用英國Malvern公司Zetasizer Nano ZS分析儀測定樣品的粒徑與zeta電位，每份樣品重復3次.

1.7 包封率測定

配制1 mg/mL VCR水溶液，倍比稀釋得到0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL溶液.紫外分光光度計(Agilent公司)，用400 μL 1%的TritonX-100，298 nm調(diào)零.分別取100 μL各濃度的長春新堿溶液加入700 μL 1%的TritonX-100溶液，制定標準曲線.取已透析好的長春新堿脂質(zhì)體50 μL加入350 μL 1%的TritonX-100，渦旋1 min，室溫放置5 min.檢測其298 nm處光吸收度，代入建好的標準曲線，即可得到脂質(zhì)體包封長春新堿的濃度.通過公式計算包封率，包封率=(脂質(zhì)體中包封的藥物/制備脂質(zhì)體所加藥物總量)×100%

1.8 免疫脂質(zhì)體的靶向特異性檢測

制備插入CFPE(488 nm激發(fā)發(fā)綠光熒光染料)的空白脂質(zhì)體(Lip).分別用上述修飾方法用anti-CD20-Fab’和BSA修飾Lip，透析去除未連接的抗體和BSA獲得免疫熒光脂質(zhì)體Clip和NLip.將Clip、NLip和Lip分別與Raji和Ramos細胞孵育，4 ℃，1 h.然后使用BD流式細胞儀進行熒光檢測.

1.9 細胞殺傷實驗

以每孔3000個細胞分別接種Raji和Ramos細胞于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL).每孔加入9 μg/mL、3 μg/mL、1 μg/mL、0.3 μg/mL的CLPV、NCLPV和長春新堿溶液.每種藥物設3個復孔，另設不加藥物對照組.37 ℃，7% CO2中繼續(xù)培養(yǎng).分別在給藥后24 h和48 h，使用CCK-8 Kit試劑盒測定細胞的增殖效率.

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體粒徑檢測

應用英國Malvern公司的Zeta電位儀Zetasizer Nano ZS分別檢測空載脂質(zhì)體LP、包封長春新堿脂質(zhì)體LPV，anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質(zhì)體CLPV和BSA修飾長春新堿脂質(zhì)體NCLPV粒徑.結(jié)果顯示脂質(zhì)體在經(jīng)過脂質(zhì)體擠出器多次擠出后，LP，LPV，CLPV，NCLPV的平均粒徑分別為134、140、141、150 nm，四種脂質(zhì)體平均粒徑均小于200 nm, 分布均勻，呈正態(tài)性，跨距較小(圖1).

注：(A)空載脂質(zhì)體LP，(B)包封長春新堿脂質(zhì)體LPV，(C)anti-CD20 Fab’免疫化長春新堿脂質(zhì)體CLPV，(D) BSA修飾長春新堿脂質(zhì)體NCLPV粒徑.

圖1脂質(zhì)體粒徑檢測

2.2 包封率

圖2 標準曲線

首先制備長春新堿1%的TritonX-100溶液298 nm濃度-光吸收標準曲線(圖2)，50 μL制備好的長春新堿脂質(zhì)體加入350 μL 1%的TritonX-100測得OD值0.365，將測得的OD值代入方程y=1.7304x-0.007，OD值為Y值，計算可得濃度為0.215 mg/mL，包裹的總體積為2 mL，即：0.215 mg/mL×2 mL=0.43 mg，脂質(zhì)體制備時長春新堿投料量為0.5 mg，所以測得包封率.包封率=(脂質(zhì)體中包封的藥物/制備脂質(zhì)體所加藥物總量)×100%=0.43/0.5×100%=86%.

2.3 免疫化脂質(zhì)體與CD20陽性細胞的結(jié)合特異性

熒光標記的脂質(zhì)體Lip， Anti-CD20 Fab’免疫化熒光脂質(zhì)體Clip和BSA修飾免疫熒光脂質(zhì)體Nlip，分別與CHO細胞(CD20-)、Raji細胞(CD20+)以及Ramos細胞(CD20+)孵育，流式細胞儀檢測他們與CHO細胞(圖3)、Raji細胞(圖4)以及Ramos細胞(圖5)的結(jié)合特異性.三種脂質(zhì)體與CHO均幾乎不能結(jié)合，Clip可以與CD20+細胞Raji和Ramos高親和力特異性結(jié)合(結(jié)合率分別達到90.3%和83.0%)，非免疫化Lip與BSA修飾Nlip與CD20+細胞Raji和Ramos幾乎不能結(jié)合.

注：(A)Clip與CHO細胞的結(jié)合率為3.66%；(B)Nlip與CHO細胞的結(jié)合率為1.45%；(C)Lip與CHO細胞的結(jié)合率為0.280%.

圖3免疫化和非免疫化脂質(zhì)體與CHO細胞的結(jié)合特異性

注：(A) Clip與Raji細胞的結(jié)合率為90.3%；(B)Nlip與Raji細胞的結(jié)合率為1.36%；(C)Lip與Raji細胞的結(jié)合率為0.180%.

圖4免疫化和非免疫化脂質(zhì)體與Raji細胞的結(jié)合特異性

注：(A)Clip與Ramos細胞的結(jié)合率為83.0%；(B)Nlip與Ramos細胞的結(jié)合率為1.10%；(C)Lip與Ramos細胞的結(jié)合率為0.290%.

圖5免疫化和非免疫化脂質(zhì)體與Ramos細胞的結(jié)合特異性

2.4 CLPV、NCLPV和VCR對B淋巴瘤細胞的靶向殺傷

CLPV與NCLPV和VCR分別以0.3，1，3，9 μg/mL四個不同濃度梯度處理Raji和Ramos細胞24 h和48 h，CCK-8 kit試劑盒檢測細胞增值率，計算IC50(表1)，檢測CLPV與NCLPV和VCR對Raji和Ramos細胞的殺傷毒性.結(jié)果表明結(jié)果免疫化長春新堿脂質(zhì)體24 h，48 h IC50值均遠低于NCLPV和VCR.CLPV較NCLPV和VCR顯著的提高了對B淋巴瘤細胞的殺傷作用(*p<0.05，**p<0.01)，而NCLPV和VCR的殺傷效果較低；從時間點上觀察，48 h的CLPV、NCLPV和VCR的細胞殺傷效果差距比24 h的差距更為明顯.含有相同長春新堿濃度的CLPV對B淋巴瘤細胞殺傷效果比NCLPV和VCR的殺傷效果要提高10%-25%(圖6).

表1 制備的各種脂質(zhì)體的IC50值

3 討論

惡性腫瘤現(xiàn)已超越心腦血管疾病成為全球第一位的死亡病因.據(jù)2011年公布的全球最新最全的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者，760萬人死于癌癥.世界衛(wèi)生組織估計到2020年前，全球每年新增癌癥患者將達到1500萬.

化學藥物治療是當今癌癥治療的主要手段之一，臨床上有超過40種常用化療藥物用于治療各種癌癥.然而化療藥物往往因其對正常細胞和癌癥細胞無差別的毒性而“殺敵一千，自損八百”，引起嚴重的毒副作用.要進一步提高惡性腫瘤的醫(yī)療水平，除了研發(fā)新藥，開發(fā)現(xiàn)有臨床藥物的新劑型，提高其對癌癥組織的靶向性是一條切實可行的思路.自1965年Bangham等人發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)體以來，經(jīng)過眾多科研人員近五十年的不懈努力，脂質(zhì)體以其生物體內(nèi)可降解，毒性低，無免疫原性，肝、脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的被動靶向性等特性，作為藥物傳遞系統(tǒng)取得了許多里程碑式的工作，如：pH梯度包埋法的發(fā)明，長循環(huán)脂質(zhì)體(隱型脂質(zhì)體)的制備及主動靶向脂質(zhì)體的發(fā)明等.現(xiàn)如今已經(jīng)有阿霉素脂質(zhì)體注射液Doxil，紫杉醇脂質(zhì)體Taxosomes，阿霉素檸檬酸鹽脂質(zhì)體注射液Myocet等多個脂質(zhì)體藥物上市.

注：(A)處理Raji細胞24 h;(B)處理Raji細胞48 h;(C)處理Ramos細胞24 h;(D)處理Ramos細胞

48 h(*p<0.05，**p<0.01).

圖6 CLPV、NCLPV和VCR對B淋巴瘤細胞的靶向殺傷

本課題結(jié)合當前最先進的脂質(zhì)體制備技術(shù)和單克隆抗體藥物的研發(fā)成果，探索一種以CD20+非霍奇金淋巴瘤為靶點的長循環(huán)免疫脂質(zhì)體制備方法.以鞘磷脂、膽固醇、DSPE-P EG、Mal-PEG2000-DSPE為處方脂材制備脂質(zhì)體，以pH梯度法DSPE-PEG的加入使脂質(zhì)體表面PEG化，獲得長循環(huán)脂質(zhì)體(隱型脂質(zhì)體)降低脂質(zhì)體的被動靶向性，以anti-CD20 Fab’對脂質(zhì)體進行免疫化修飾，使脂質(zhì)體具有主動靶向性.

通過粒徑和包封率對制備的脂質(zhì)體進行表征分析.粒徑分析表明，我們獲得的長循環(huán)空白脂質(zhì)體(LP)平均粒徑為134 nm.pH梯度法包封長春新堿后獲得的長循環(huán)長春新堿脂質(zhì)體(LPV)粒徑較LP略有增大，平均粒徑為140 nm.而對LPV進行anti-CD20-Fab’修飾最終獲得長循環(huán)長春新堿免疫脂質(zhì)體(CLPV)，平均粒徑141 nm，較LPV幾乎沒有變化.以上結(jié)果表明我們制備的長循環(huán)空白脂質(zhì)體(LP)，長循環(huán)長春新堿脂質(zhì)體(LPV)，長循環(huán)長春新堿免疫脂質(zhì)體(CLPV)平均粒徑均在150 nm以下，作為藥物載體具有很好的粒徑分布范圍，而且粒徑分析圖也表明粒徑分布均勻，呈正態(tài)性，且跨距較小.包封率分析表明，我們獲得了86%的包封率，說明pH梯度法在將來的長春新堿脂質(zhì)體工業(yè)化制備過程中具有良好的應用前景.

體外抗腫瘤實驗表明獲得的長春新堿免疫脂質(zhì)體其具有較好的生物活性.結(jié)合特異性分析表明anti-CD20修飾脂質(zhì)體對CD20+陽性的Raji和Ramos具有90%和83%的結(jié)合率，而非修飾脂質(zhì)體和BSA修飾脂質(zhì)體對照與兩種細胞的結(jié)合率均低于5%.然而anti-CD20修飾脂質(zhì)體同非修飾脂質(zhì)體和BSA修飾脂質(zhì)體一樣與CD20-的CHO細胞結(jié)合率均低于5%，結(jié)合實驗說明anti-CD20修飾使脂質(zhì)體其具有了與CD20+細胞的超強的靶向性特異性和超高的親和力，這就為脂質(zhì)體特異性遞藥到腫瘤組織提供了保證.

體外殺傷實驗表明在相同長春新堿給藥濃度的情況下，長春新堿免疫脂質(zhì)體(CLPV)比BSA修飾長春新堿脂質(zhì)體(NCLPV)和游離長春新堿(VCR)對CD20+細胞Raji細胞和Ramos的24 h和48 h殺傷能力都更強，殺傷效率提高10-25%左右.IC50計算得到CLPV的對Raji和Ramos細胞的24 h，48 h殺傷的IC50值都是NCLPV和VCR50%以下，預示著臨床上可以顯著降低給藥劑量，進一步降低藥物毒性.以上實驗表明Anti-CD20 Fab’通過提高長春新堿脂質(zhì)體對CD20+的靶向特異性和結(jié)合效率賦予了長春新堿脂質(zhì)體良好的體外抗腫瘤細胞的活性.