張鴻雁 高擎 張琳園 林國莉 李如蓮

（1. 嶺南師范學院生命科學與技術學院，湛江 524048；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319）

大豆疫病（大豆疫霉根腐?。┦谴蠖股a(chǎn)中的一種毀滅性病害，全球范圍內(nèi)皆可發(fā)生［1］。病原菌大豆疫霉（Phytophthora sojae）在土壤和病殘體中越冬，在大豆整個生育期都可侵染，使得種子、根、莖腐爛，植株枯死，造成嚴重的經(jīng)濟損失［2］。對大豆疫病的防治一般采用化學藥物處理或選育抗病品種等方法。其中化學藥物防治，如利用福美雙、多菌靈等拌種來起到殺菌作用，但疫霉菌對化學藥劑抗性較強，通過化學藥物很難徹底根治［3］，且有農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和食品污染等弊端?？共∑贩N防治的問題是抗病品種較少和抗性容易被克服等［4］。因此，開發(fā)具有防病抗病，綠色無污染的生物防治方法是一種大豆疫病防控的良好途徑。

大豆疫病的生物防治研究主要是利用細菌［5］、放線菌［6］或霉菌［7］作為拮抗菌，其中以細菌為主［8］。鏈霉菌是土壤中一種含量較多的放線菌，能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，具有促生抗病等多種作用［9-11］，在植物病害生物防治中具有潛在的應用價值。本研究從大豆根際土壤中分離出具有拮抗作用的鏈霉菌，對其中拮抗效果明顯的XS1-5菌株進行抗病促生作用研究，并確定其分類地位，期望為大豆疫病的生物防治提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品：采集自黑龍江省綏化市安達大豆農(nóng)田土壤，經(jīng)緯度為N46°24'10.2"，E125°21'59.5"。土壤基本理化性質(zhì)為有機質(zhì)46.04 g/kg、速效氮226.3 mg/kg、速效磷9.35 mg/kg、速效鉀171.9 mg/kg，pH6.90。收集5-30 cm深度范圍內(nèi)土壤，多點取樣，混勻使用。

病原菌：大豆疫霉（P. sojae）由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院分離保藏。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離、純化 采集健康大豆根際土壤，置于裝有少量石英砂和無菌水的三角瓶中，搖床振蕩30 min，經(jīng)系列稀釋，涂布于含50 mg/mL重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，觀察。選擇孢子量豐富的放線菌經(jīng)劃線純化，轉接于斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗放線菌篩選

1.2.2.1 放線菌與拮抗菌的皿內(nèi)拮抗作用 瓊脂塊法抑菌試驗［12］。病原菌接種于PDA斜面試管，于25℃培養(yǎng)3-4 d，無菌水制成菌懸液。將菌懸液均勻涂布于PDA平板，用打孔器從培養(yǎng)7 d的待篩放線菌平皿中打取直徑為5 mm的放線菌瓊脂塊，正置于PDA平板上，28℃培養(yǎng)5-7 d，測定抑菌圈直徑（D）及抑菌圈透明度（T）。根據(jù)拮抗環(huán)寬度、透明度、放線菌產(chǎn)孢量，挑選出有應用價值的拮抗菌用于后續(xù)試驗。

1.2.2.2 放線菌無菌發(fā)酵濾液對病原菌菌絲作用 生長速率法抑菌試驗［13］。將供試放線菌以一定比例接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d。發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min后，用0.45 μm滅菌微孔濾膜過濾除菌，得無菌濾液。將濾液不同濃度與冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基按1∶4體積比混勻倒平板，以同比例加入無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照。用5 mm打孔器打取病原菌菌餅，置于PDA平板中央，每處理3次重復，25℃培養(yǎng)7 d，定時測量菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.3 拮抗菌鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學觀察和生理生化特征 將菌株XS1-5接種在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，利用插片法觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及孢子絲的形態(tài)特征。XS1-5菌落形態(tài)觀察采用蔗糖硝酸鹽瓊脂、葡糖天冬素瓊脂、淀粉瓊脂、甘油蘋果酸鈣瓊脂和營養(yǎng)瓊脂，觀察記錄氣生菌絲顏色、基內(nèi)菌絲顏色、可溶性色素顏色。對菌株進行碳源利用、明膠液化、淀粉水解、纖維素降解、牛奶胨化、硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原、類黑素的產(chǎn)生試驗等，測定其生理生化特征［14］。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 采用細菌基因組提取試劑盒提取菌株XS1-5全基因組DNA。細菌通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-AGGAGG TGATCCAGCCGCA-3'）對其16S rRNA基因序列進行PCR擴增。PCR反應體系：10×Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，Primer A 1.0 μL，Primer B 1.0 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 37.7 μL，提取的總DNA 1.0 μL，總體積為50 μL。反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，57℃退火55 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳后測序。將測得的16S rRNA序列經(jīng)過序列拼接后，利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，獲得最相近菌株的序列，用Clustalx1.8按照最大同源性的原則進行排序，采用MEGA5軟件Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 盆栽試驗 分別以XS1-5孢子濃度0.1×108CFU/g、1.0×108CFU/g和10.0×108CFU/g進行大豆種子包衣處理。0.7%的羧甲基纖維素鈉作為粘附劑，以只加粘附劑不加孢子包衣為對照。

生物量測定：以直尺測量株高、根長，百分位電子天平稱量大豆地上鮮重、地下鮮重。

葉綠素含量參照白寶璋等［16］的方法，根系活力采用TTC法（紅四氮唑）［15］。

葉片和根系酶活力測定：參考王寶成等［14］方法。過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外分光光度法，以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活性單位（U）；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法，以抑制NBT光還原50%的酶量為1個酶活力單位（U）；氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470變化0.01為1個酶活性單位（U）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，Duncan法進行單因素多重比較（P<0.05），并用Excel 2016進行圖表的制作，文中數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 拮抗菌篩選

2.1.1 放線菌與拮抗菌的皿內(nèi)拮抗作用 從大豆根際共分離放線菌163株。163株放線菌經(jīng)與病原菌大豆疫霉瓊脂塊皿內(nèi)拮抗實驗驗證，獲得拮抗效果較明顯的菌株7株。7株菌的抑菌圈結果見表1。由表1可知，7株拮抗放線菌抑菌圈透明，孢子較豐富。其中抑菌圈超過15 mm的菌株3株，分別為XS1-5、GF1和X9，抑菌圈直徑分別為20.5 mm、15.2 mm和15.7 mm，顯著高于其他菌（P<0.05）。選擇3株菌做生長速率試驗。

表1 拮抗放線菌對大豆疫霉的皿內(nèi)拮抗作用

2.1.2 放線菌無菌發(fā)酵濾液對病原菌菌絲的作用 皿內(nèi)拮抗作用選得3株拮抗菌，其無菌發(fā)酵濾液對病原菌大豆疫霉的抑菌作用結果見表2。由表2可知，3株拮抗菌不同濃度無菌發(fā)酵濾液對病原菌大豆疫霉都有不同程度的抑制作用，抑菌率為12.4%-90.9%。且表現(xiàn)為隨著時間的延長，濾液的抑菌率先逐漸升高后有所下降。同時，由表2還可以看出，3株菌濾液經(jīng)稀釋后其抑菌效果皆不如原液，差異顯著（P<0.05）。XS1-5原液的抑菌率可達90%以上，高于GF1和X9，差異顯著（P<0.05）。選擇XS1-5做后續(xù)試驗。

2.2 拮抗菌鑒定

菌株XS1-5的培養(yǎng)特征、碳源利用及生理生化特征見表3、表4和表5。在不同供試培養(yǎng)基上XS1-5的氣生菌絲白色或無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲無色到紅色，無可溶性色素（表3）。光學顯微鏡下（10×40）可見孢子絲直，偶有螺旋。XS1-5可以利用蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖和肌醇，不能利用棉子糖、乳糖、木糖和阿拉伯糖（表4），明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原陽性，不降解纖維素，不能進行牛奶胨化、不產(chǎn)硫化氫和類黑色素（表5）。

表2 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對大豆疫霉的抑菌率

表3 拮抗菌XS1-5在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

表4 拮抗菌XS1-5的碳源利用

表5 拮抗菌XS1-5的生理生化特征

圖1 菌株XS1-5的系統(tǒng)進化分析

對菌株XS1-5的16S rRNA基因序列進行PCR擴增，得到大約1 300 bp片段。經(jīng)與GenBank中相關數(shù)據(jù)進行BLAST相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，建樹結果見圖1。由圖1可知，與菌株XS1-5 16SrRNA同源性較高的均為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。其中與白孢鏈霉菌（Streptomyces albosporeus）的序列相似性高達100%。結合形態(tài)特征、生理生化指標與分子生物學分析，XS1-5鑒定為白孢鏈霉菌（S.albosporeus）。綠素c分別增加50.6%、12.22%、15.81%和7.93%（P<0.05）。對于葉綠素a、總葉綠素和葉綠素c，10.0×108CFU/g孢子濃度含量與1.0×108CFU/g作用效果相當。由表7還可看出，3種濃度的拮抗菌XS1-5包衣對根系活力的促進作用為1.0×108CFU/g最強，為685.41 μg/g.h，比對照增加了138.38%，是對照的約2.4倍（P<0.05）。其他兩種濃度對大豆根系活力的促進作用與對照相比差異亦顯著，分別比對照增加了80.79%（10.0×108CFU/g）和74.96%（0.1×108CFU/g）。

2.3.3 拮抗菌XS1-5對大豆保護性酶活力的影響 拮抗菌XS1-5對大豆葉片和根系保護性酶CAT、SOD和POD活力的影響結果見表8。由表8可知，拮抗菌XS1-5處理種子使葉片和根系3種保護性酶活力皆有所增加。與對照相比，1.0×108CFU/g處理使葉片保護性酶CAT、SOD和POD活力分別增加158.86%、459.71%和135.45%，差異顯著（P<0.05），0.1×108CFU/g包衣后葉片SOD增加315.69%，是對照的近6倍。1.0×108CFU/g處理使根系CAT、SOD和POD活力分別比對照增加109.33%、146.03%和27.60%（P<0.05）。

表6 拮抗菌XS1-5對大豆生長的影響

3 討論

大豆疫病是一種土傳病害，由大豆疫霉菌侵染導致。該菌擴展迅速、危害嚴重，對大豆產(chǎn)量影響較大，現(xiàn)世界大部分大豆產(chǎn)區(qū)均有大豆疫病發(fā)生的報道［17］。

生物防治植物土傳病害因其綠色、安全、無污染等特點，是較有潛力的防治方法。目前對大豆疫病的生物防治應用研究非常廣泛。楊光紅等［18］從大豆根圍土樣中篩選得到對大豆疫霉有較好拮抗作用的生防細菌菌株BY-2，經(jīng)平板測定，生防菌株BY-2的防效最好，盆栽灌根大豆幼苗的鮮重、干重、根長和莖長顯著增加，表明生防菌株BY-2能促進大豆植株的生長。王愷等［19］分離到一株對大豆疫霉具有較強抑制作用的放線菌1-17，平板對峙抑菌直徑在17.81 mm以上，為鏈霉菌屬S. humidussp.。本研究篩選到一株對大豆疫霉具有明顯拮抗活性的鏈霉菌XS1-5，并結合形態(tài)學、生理生化特征和16S rRNA序列測定將其鑒定為白孢鏈霉菌。目前國內(nèi)外關于白孢鏈霉菌的研究有產(chǎn)生可以殺原核微生物的抗生素［20］和幾丁質(zhì)［21］的報道，但未見其對真核微生物的作用及在農(nóng)業(yè)植物病害防治應用的相關試驗報道。本研究表明鏈霉菌XS1-5及其發(fā)酵液能抑制大豆疫霉病原菌生長，抑菌圈直徑達20.5 mm，抑菌率達90.9%，盆栽試驗表明其促進大豆生長、提高葉片葉綠素含量和根系活力，具有明顯的促生抗病作用。

表7 拮抗菌XS1-5對大豆葉綠素和根系活力的影響

表8 拮抗菌XS1-5對大豆根系和葉片酶活性的影響

另外，本研究篩選到的白孢鏈霉菌XS1-5還可以提高大豆的保護性酶活性。植物受到病原物侵染而發(fā)生主動防衛(wèi)反應時，體內(nèi)一系列保護性酶發(fā)生了廣泛的病理變化，提高植物的抗病性。Patel等［22］研究表明，番茄根際獲得細菌Providencia rettgeriMSS2盆栽試驗使得番茄多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等保護性酶活性增強。朱學明等［23］采用噴霧接種方法，發(fā)現(xiàn)放線菌A-1顯著提高了葉片中保護性酶CAT、SOD、POD、PPO和PAL的活性，提高寄主對炭疽葉枯病的抗性。臺蓮梅等［7］發(fā)現(xiàn)木霉菌株T115D誘導大豆葉片CAT、SOD、POD、PPO和PAL的活性增強。目前對根系保護性酶活性研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)白孢鏈霉菌XS1-5孢子對大豆種子包衣可以顯著提高葉片和根系CAT、SOD和POD的活性，對大豆防御外來病原菌的感染有重要作用，抗病促生機理及次及代謝產(chǎn)物中抗菌物質(zhì)待后續(xù)研究。

4 結論

本研究利用瓊脂塊法和生長速率法篩選到大豆疫霉拮抗菌XS1-5，經(jīng)形態(tài)、理化指標和分子生物學指標鑒定為白孢鏈霉菌，并進行了大豆盆栽試驗，測定大豆生長情況、葉綠素含量、根系活力和保護性酶活性等指標，發(fā)現(xiàn)拮抗菌XS1-5具有促生抗病作用，推斷XS1-5在大豆疫病的生物防治上有較好的應用價值。