張瑞平 楊峰 陳樂(lè)章 鄧星光 張大偉

（1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064；2. 四川省煙草公司攀枝花市公司，攀枝花 617099；3. 四川惠泰農(nóng)業(yè)科技有限公司，成都 610200）

植物在生長(zhǎng)和發(fā)育的過(guò)程中面臨著多種環(huán)境脅迫。植物為了在環(huán)境中生存，進(jìn)化出一系列復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制來(lái)感受環(huán)境變化的信號(hào)并調(diào)整自身適應(yīng)環(huán)境刺激。其中，植物激素對(duì)調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境的響應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。此外，有研究證明線粒體交替呼吸途徑也參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)［1-2］。

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）是一類(lèi)重要的甾醇類(lèi)植物激素，它廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、光形態(tài)建成、根與氣孔發(fā)育等多個(gè)過(guò)程［3-4］。目前BR在植物中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)研究得比較清楚。BR首先被定位于細(xì)胞膜上的受體激酶BRI1所感知［5］。另一個(gè)膜受體激酶BAK1，能夠與BRI1結(jié)合，并起到增強(qiáng)BR信號(hào)的作用［6］。BR被感知后通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)磷酸化反應(yīng)最終激活BES1/BZR1家族轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)節(jié)成千上萬(wàn)靶基因的表達(dá)［7］。BR除了調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程之外，也參與調(diào)控植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)如抗冷、抗鹽、抗干旱、抗重金屬毒害等［4，8-9］。

線粒體呼吸是植物產(chǎn)生ATP的主要來(lái)源。植物線粒體中除細(xì)胞色素呼吸途徑外，還具有一條對(duì)氰化物不敏感的電子傳遞途徑，即抗氰呼吸途徑，也叫交替呼吸途徑［2］。交替氧化酶（Alternative oxidase，AOX）是交替呼吸電子傳遞鏈中的末端氧化酶，對(duì)植物抗氰呼吸起到了主要的調(diào)控作用［10］，是植物調(diào)控抗逆網(wǎng)絡(luò)的重要成員。目前研究發(fā)現(xiàn)AOX參與調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫［11］、鹽脅迫［12］、冷脅迫［13］以及病原物的抗性［14］。盡管如此，有關(guān)交替呼吸途徑調(diào)控植物抗逆的作用機(jī)制仍不清楚。

高溫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子。隨著全球氣候的變暖，高溫導(dǎo)致的熱脅迫嚴(yán)重制約作物的生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量，極端的高溫甚至造成植被的死亡［15］。因此，研究植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)BR可以在高溫下促進(jìn)植物下胚軸的伸長(zhǎng)［16］，然而其如何調(diào)控植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)還不清楚。本研究以本氏煙草為材料，探究交替呼吸途徑在BR調(diào)控植物響應(yīng)高溫逆境中的作用機(jī)制，旨為培育高產(chǎn)抗逆遺傳改良作物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用植物材料為野生型本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)試劑處理 BL（最具活性的BR）購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries公司（日本）。交替途徑抑制劑水楊基異羥肟酸（Salicylhydroxamic acid，SHAM）購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。所有的藥劑溶于含0.02%吐溫20的超純水中。各試劑濃度如下：BL，0.1 μmol/L；SHAM，1 mmol/L。對(duì)照為含0.02%吐溫20的超純水。

1.2.2 高溫脅迫處理 實(shí)驗(yàn)所用植株在溫室內(nèi)生長(zhǎng)，溫度為25℃。光照強(qiáng)度為100 μmol/m-2·s。光照條件為每天16 h光照，8 h黑暗。將正常條件下生長(zhǎng)3周的幼苗轉(zhuǎn)移至37℃熱脅迫環(huán)境下處理3 d。

1.2.3 病毒誘導(dǎo)的基因沉默 本實(shí)驗(yàn)所用基因沉默方法為煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介導(dǎo)的植物沉默方法（VIGS）。NbAOX1編碼區(qū)片段 用 引 物F：GGAGGATGGATCAAAGCAC & R：ATGGCAATAGCAGGAGCAG擴(kuò) 增 所 得，片 段 純化后定向插入至pCRTM8/GW/TOPOTMTA Cloning Kit（Invitrogen，美國(guó)）質(zhì)粒，通過(guò)GatewayTMLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒（Invitrogen）經(jīng)LR反應(yīng)后交換至pTRV2質(zhì)粒。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101株系。搖菌過(guò)夜后離心，用瞬時(shí)表達(dá)緩沖液（10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，和200 μmol/L乙酰丁香酮）重懸后靜置3 h。將含pTRV1的農(nóng)桿菌重懸液和帶有目的片段的pTRV2農(nóng)桿菌重懸液按照1∶1的比例混合，通過(guò)無(wú)菌針管注射至本氏煙葉片。

1.2.4 呼吸檢測(cè)方法 植物呼吸測(cè)定用Clark型氧電極（英國(guó)），取50 mg葉片并將其剪成碎片，懸浮于20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液中（pH 6.8），等待15 min后進(jìn)行呼吸測(cè)定，以避免機(jī)械損傷誘導(dǎo)呼吸。不加呼吸抑制劑時(shí)測(cè)得的數(shù)值為總呼吸Vt；同時(shí)加入細(xì)胞色素途徑抑制劑KCN（終濃度為1 mmol/L）和交替途徑抑制劑n-丙基沒(méi)食子酸（終濃度為0.5 mmol/L）測(cè)得剩余呼吸Vr；僅加入1 mmol/L KCN時(shí)測(cè)得的呼吸活性為V0。細(xì)胞色素呼吸值Vcyt=Vt-V0；交替呼吸值Valt=V0-Vr。上述呼吸量均以μmol O2·mg-1FW min-1表示。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，取平均值。

1.2.5 RNA提取及RT-PCR 葉片總RNA提取用了全式金公司（中國(guó)）植物總RNA提取試劑盒，提取方法參照說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄采用Invitrogen公司（美國(guó)）SuperScript III Reverse Transcriptase試劑盒。熒光定量PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)使用TaKaRa公司（日本）的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行，NbAOX1（序列號(hào)：KF367455）基因表達(dá)檢測(cè)引物序列為F：TGAATGATAAGCAGCACGAT & R：TGACGGTCCAATAAGCAAA，內(nèi)參基因NbACTIN（序列號(hào)：AY179605）擴(kuò)增引物序列為F：ACTGATGAAGATACTCACA & R：CAGGATACGGGGAGCTAAT。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定采用飽和脈沖分析方法，數(shù)據(jù)采集通過(guò)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAG-MINI（德國(guó)）。植物首先暗處理30 min，打開(kāi)測(cè)量光，記錄暗處理后初始熒光值Fo；打開(kāi)飽和脈沖并持續(xù)0.8 s，測(cè)得暗處理后最大熒光值Fm；關(guān)閉飽和脈沖，打開(kāi)光化光，記錄葉綠素?zé)晒鈴暮诎档焦庹盏捻憫?yīng)過(guò)程，等熒光曲線趨于穩(wěn)定時(shí)關(guān)閉光化光，打開(kāi)飽和脈沖0.7秒，此時(shí)測(cè)得葉綠素?zé)晒夥逯礔m'。光系統(tǒng)II的最大光效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm；非光化學(xué)淬滅值NPQ=（Fm/Fm'）- 1。

1.2.7 抗氧化系統(tǒng)活力測(cè)定 取500 mg葉片于5 mL提取液［含25 mmol/L PBS，0.2 mmol/L EDTA，2 mmol/L抗壞血酸和2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）pH7.8］中研磨。12 000 r/min低溫離心20 min，取上清液用來(lái)檢測(cè)抗氧化酶活性。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（Guaiacol peroxidase，GPX）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）活性檢測(cè)方法參照Xu等［17］的文章。

1.2.8 植物氧化損傷分析 超氧化物用0.5 mg/mL硝基氯化四氮唑藍(lán)（Nitro blue tetrazolium，NBT）染色2 h。過(guò)氧化氫用2 mg/mL 3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）染色8 h。

葉片相對(duì)含水量RWC=（Fw-Dw）/（Tw-Dw）×100%。其中Fw代表葉片濕重；Dw代表葉片干重；Tw代表葉片飽和吸水重量。

電導(dǎo)率（Electrolyte leakage，EL）表示植物細(xì)胞質(zhì)膜的透性，檢測(cè)方法如下：取0.5 g新鮮葉片，洗凈后用剪刀將其剪碎，加入5 mL超純水后真空抽濾20 min，在室溫下靜置1 h，用電導(dǎo)率儀器測(cè)試電導(dǎo)率Ri。然后沸水浴中煮5 min，冷卻到室溫然后再測(cè)定電導(dǎo)率Rt，相對(duì)電導(dǎo)率Ro=Ri/Rt。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量可以用來(lái)表示細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化情況，其定量方法參考Deng等［9］文章。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫下BR激活交替呼吸途徑

為了探索高溫逆境下BR與交替呼吸途徑之間的關(guān)系，首先檢測(cè)了BR處理后本氏煙交替呼吸的變化情況。結(jié)果顯示在正常生長(zhǎng)條件下，與對(duì)照組（水處理）相比植株在噴施BL后交替呼吸強(qiáng)度顯著上調(diào)，NbAOX1表達(dá)量也表現(xiàn)出明顯上升。在化學(xué)試劑處理 12 h后，將植株移至37℃生長(zhǎng)條件下，并連續(xù)檢測(cè)了其交替呼吸及AOX1表達(dá)量隨時(shí)間的變化。如圖1所示，高溫逆境條件下生長(zhǎng)的植物，其抗氰呼吸、AOX1基因表達(dá)水平高于正常生長(zhǎng)條件下的植株；這種趨勢(shì)在BL處理后更為顯著。這些結(jié)果說(shuō)明BR能夠誘導(dǎo)植物AOX途徑以響應(yīng)高溫逆境。

圖1 BR誘導(dǎo)交替呼吸Valt及NbAOX1表達(dá)量隨時(shí)間的變化

2.2 BR誘導(dǎo)的交替途徑減高溫緩脅迫對(duì)光系統(tǒng)的損傷

為了進(jìn)一步分析交替呼吸途徑在BR介導(dǎo)的植物抗高溫中的功能，我們通過(guò)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)分析了熱脅迫下植物光系統(tǒng)II的功能。如圖2所示，正常生長(zhǎng)條件下，對(duì)照組與處理組植株光系統(tǒng)II參數(shù)無(wú)明顯差別。在高溫脅迫下，噴施BL的植株其光系統(tǒng)II的最大光效率Fv/Fm比水處理植株高（圖2-A-B）。相反，BL處理植株非光化學(xué)淬滅值NPQ比水處理植株低（圖2-C-D）。然而，BL處理對(duì)植物光系統(tǒng)的保護(hù)作用在交替途徑抑制劑SHAM存在時(shí)會(huì)受到抑制。為了進(jìn)一步分析AOX1對(duì)BR誘導(dǎo)植物抗逆的影響，用VIGS技術(shù)沉默了NbAOX1基因。與SHAM共處理相似，在高溫處理下，NbAOX1沉默植株中噴施BR不能夠明顯上調(diào)Fv/Fm及下調(diào)NPQ（圖2）。這些結(jié)果證明BR誘導(dǎo)的交替途徑能夠在逆境中保護(hù)植物光系統(tǒng)。

圖2 交替呼吸途徑參與BR緩解植物在逆境中的光系統(tǒng)損傷

2.3 高溫逆境下BR誘導(dǎo)的交替途徑減輕ROS的積累

植物在響應(yīng)逆境脅迫時(shí)往往會(huì)伴隨著ROS的積累。本研究用NBT及DAB染色法檢測(cè)了植株中超氧化物及過(guò)氧化氫的含量。這兩種方法都檢測(cè)到脅迫條件下ROS積累明顯變多，而B(niǎo)R處理會(huì)在一定程度上降低ROS的積累。然而在SHAM預(yù)處理或NbAOX1沉默植株中，BR緩解ROS積累的情況受到顯著抑制（圖3-A-B）。

組織的電導(dǎo)率（EL）、MDA及相對(duì)含水量（RWC）這些生理指標(biāo)被常用來(lái)表現(xiàn)植物在逆境中受到氧化損傷的情況。與ROS積累相似，高溫脅迫能夠?qū)е轮仓闑L及MDA含量上升。與水處理植株相比，BL處理植株表現(xiàn)出更低水平的細(xì)胞死亡、EL及MDA含量（圖3-C-D）。植物在逆境中RWC會(huì)明顯降低，而在相同條件下，BL處理后的植株中RWC明顯高于水處理植株（圖3-E）。然而，熱脅迫處理后BR對(duì)以上3個(gè)生理參數(shù)的調(diào)控作用在SHAM共處理或NbAOX1沉默植株中會(huì)受到抑制。

2.4 高溫逆境下交替呼吸途徑對(duì)BR激活本氏煙抗氧化系統(tǒng)的影響

植物中抗氧化系統(tǒng)能夠減緩植物在逆境下所受的氧化損傷。本研究也檢測(cè)了4種抗氧化酶活性的變化情況，包括：超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT、抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX和愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶GPX。如圖4所示，在正常生長(zhǎng)條件下，對(duì)照組與處理組植株抗氧化酶活性無(wú)明顯差別。在熱脅迫處理后，抗氧化酶活性明顯上調(diào)，而這些上調(diào)在噴施BL植株中要強(qiáng)于噴施水的植株。有趣的是，SHAM處理或沉默NbAOX1基因能夠抑制BR激活這4種抗氧化酶的活性。

圖3 交替呼吸途徑參與BR緩解高溫逆境對(duì)植物造成的氧化損傷

圖4 高溫逆境下交替呼吸途徑參與BR激活本氏煙抗氧化酶活性

3 討論

有關(guān)交替呼吸途徑在植物響應(yīng)逆境方面調(diào)控的研究越來(lái)越多，在過(guò)去十幾年內(nèi)，人們發(fā)現(xiàn)AOX可能是線粒體調(diào)控植物抗逆的重要成員之一。許多逆境脅迫如冷脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫等都能誘導(dǎo)植物抗氰呼吸、AOX轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上調(diào)［11，17-18］。有研究報(bào)道植物激素能夠誘導(dǎo)交替呼吸途徑。在煙草中，低濃度的水楊酸能夠誘導(dǎo)AOX基因表達(dá)及抗氰呼吸［19］。植物響應(yīng)逆境時(shí)乙烯信號(hào)常常與交替呼吸途徑存在多重交叉影響［12，17］。這些研究都說(shuō)明植物中交替途徑與植物激素間存在一定聯(lián)系。本研究證明了在本氏煙草中BR也能夠誘導(dǎo)交替途徑，外施BR能夠誘導(dǎo)植物抗氰呼吸及NbAOX1基因轉(zhuǎn)錄水平，這些結(jié)果為BR與交替呼吸途徑之間存在關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)。有意思的是，BR對(duì)交替呼吸途徑的誘導(dǎo)作用在高溫逆境下尤為顯著，這暗示了交替途徑可能參與BR調(diào)控植物響應(yīng)高溫逆境的過(guò)程。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了交替呼吸途徑在BR誘導(dǎo)植物對(duì)熱脅迫抗性的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。無(wú)論是通過(guò)化學(xué)試劑處理還是基因沉默方法抑制交替呼吸途徑后，高溫逆境下BR處理對(duì)煙草光合系統(tǒng)的保護(hù)能力受到了一定程度的抑制。

BR誘導(dǎo)的交替呼吸途徑很可能在某種程度上緩解了高溫逆境下ROS的過(guò)量積累。一般來(lái)說(shuō)，AOX能夠通過(guò)降低植物線粒體內(nèi)泛醌的含量從而抑制ROS的合成［20-21］。已有研究報(bào)道了過(guò)表達(dá)AOX基因能夠降低植物中ROS的含量［22-23］，植物缺失AOX基因后在逆境下會(huì)遭受更大程度的傷害［24］。在本研究中，抑制交替途徑后BR處理植株在熱脅迫條件下仍能積累大量ROS。逆境下抗氧化系統(tǒng)能夠清除過(guò)多的ROS從而保護(hù)植物免受氧化傷害。在本實(shí)驗(yàn)中，抑制交替途徑對(duì)BR在抗氧化酶活性調(diào)控方面起到了負(fù)面的影響。同樣，脅迫損傷指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在抑制交替途徑的植株中，BR處理不能有效地減緩植物遭受的逆境損傷。這些結(jié)論都說(shuō)明在高溫逆境下，交替呼吸途徑能夠幫助BR激活植物抗氧化系統(tǒng)來(lái)緩解植物的氧化損傷。

4 結(jié)論

在高溫逆境下，交替呼吸途徑能夠被BR信號(hào)激活，被激活的交替途徑能夠抑制植物在逆境中ROS的過(guò)量積累及保護(hù)光系統(tǒng)。本研究證實(shí)了交替呼吸途徑參與BR調(diào)控植物響應(yīng)逆境信號(hào)，同時(shí)也為BR信號(hào)在調(diào)控植物抗逆方面的研究提供了新的證據(jù)。