陳敏 劉旭平 趙亮

（1. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；2. 華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

口蹄疫是一種具有高度傳染性的偶蹄類動物疫病，由口蹄疫病毒（含多種血清型：O、A、C、SAT1［Southern african territories 1）、SAT2、SAT3和Asia1］引起，豬、牛、羊等養(yǎng)殖畜類及水牛等野生動物易感，感染發(fā)病率100%，其爆發(fā)會對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。目前最為有效的防控手段是口蹄疫疫苗的接種［1-5］。畜牧業(yè)的發(fā)展、種群密度的加大都增加了防疫的難度，也進(jìn)一步提高了對疫苗的需求。近年來，各類新型疫苗不斷涌現(xiàn)，大量文獻(xiàn)介紹了這些新型疫苗所能解決的、現(xiàn)有疫苗存在的問題［6-10］。但是，目前被廣泛使用的疫苗仍以滅活病毒疫苗為主?？紤]到滅活疫苗價格昂貴、保質(zhì)期短、保護(hù)作用短、需要重復(fù)接種的問題［7-10］，提高現(xiàn)有工藝的疫苗生產(chǎn)能力，加大產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本，無疑是解決當(dāng)前疫苗需求困境的最佳策略。從生產(chǎn)工藝的角度，BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)于貼壁生產(chǎn)工藝并將逐步取代后者已在領(lǐng)域內(nèi)達(dá)成共識，急需解決的是血清引入可能導(dǎo)致的安全隱患和完全無血清體系下支持高密度細(xì)胞培養(yǎng)和高效病毒擴(kuò)增的問題。

目前利用BHK-21懸浮細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒疫苗使用的接毒細(xì)胞密度通常在3×106cells/mL-5×106cells/mL，根據(jù)病毒血清型不同，收獲病毒完整顆粒在1 μg/mL-10 μg/mL不等。“細(xì)胞密度效應(yīng)”是指基于動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的病毒生產(chǎn)工藝中發(fā)生的病毒收獲量不能隨接毒時細(xì)胞密度增高而增高，甚至出現(xiàn)下降的現(xiàn)象［11-14］，是生產(chǎn)工藝在擴(kuò)大規(guī)模和提高產(chǎn)能時的主要瓶頸。這一現(xiàn)象最有可能的原因是高密度細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致體系內(nèi)重要營養(yǎng)物質(zhì)缺乏［15］（如葡萄糖、氨基酸）、有毒代謝副產(chǎn)物積累［16-17］（如乳酸、氨）以及培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)改變［18-19］（如pH），進(jìn)而影響了細(xì)胞的生理狀態(tài)以及后續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)毒過程。

本單位前期已開展了大量開發(fā)工作，獲得了能夠支持BHK-21懸浮細(xì)胞穩(wěn)定傳代和口蹄疫病毒擴(kuò)增的多個無血清培養(yǎng)基配方和生產(chǎn)工藝［20-22］。然而，在實(shí)際應(yīng)用時仍需添加低濃度的血清以達(dá)到最佳的病毒產(chǎn)量和病毒效價［20-21］。為實(shí)現(xiàn)完全的無血清培養(yǎng)工藝，本研究首先將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于前期開發(fā)的一款無血清培養(yǎng)基中［20］，觀測細(xì)胞生長和接毒時的生理代謝狀態(tài)，通過代謝通量分析，了解細(xì)胞生長和病毒擴(kuò)增時的營養(yǎng)需求以及可能導(dǎo)致有毒代謝物積累或培養(yǎng)環(huán)境惡化的原因，識別關(guān)鍵的營養(yǎng)成分，采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，旨在得到一款能夠支持BHK-21細(xì)胞高密度懸浮生長和口蹄疫病毒高效擴(kuò)增的無血清培養(yǎng)基，從而取代現(xiàn)有的低血清培養(yǎng)工藝，并獲得超高細(xì)胞密度接毒（＞107cells/mL）、病毒高產(chǎn)量和簡化接毒操作的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 BHK-21貼壁細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，使用本單位開發(fā)的無血清培養(yǎng)基懸浮馴化，并經(jīng)單克隆篩選后獲得懸浮細(xì)胞株。

1.1.2 培養(yǎng)基 優(yōu)化前的無血清培養(yǎng)基為本單位自主開發(fā)，命名為primary SFM（簡稱P-SFM），包含葡萄糖、氨基酸、維生素、微量元素以及多種血清替代物等營養(yǎng)物質(zhì)。

低血清培養(yǎng)基（簡稱LSM）為優(yōu)化前的無血清培養(yǎng)基加1%新生牛血清。

TCID50測試中使用的DMEM購自Sigma。

1.1.3 毒株 O型口蹄疫毒株，懸浮細(xì)胞生產(chǎn)獲得，由合作客戶提供，種毒TCID50值為7.25 lgTCID50/0.1mL。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細(xì)胞在搖瓶體系中的培養(yǎng) 取復(fù)蘇后可穩(wěn)定傳代且活性大于95%的BHK-21細(xì)胞用于本研究。

取處于對數(shù)生長期、活性大于95%的足量細(xì)胞置于50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入30 mL實(shí)驗(yàn)組無血清培養(yǎng)基后重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至125 mL搖瓶內(nèi)。搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為130 r/min，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。

批培養(yǎng)時，每24 h取樣計數(shù)，樣品于10 000 r/min下離心5 min，保留上清凍存于-20℃，用于營養(yǎng)代謝物的分析。

傳代培養(yǎng)或擴(kuò)培時，每48 h將細(xì)胞液用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至活細(xì)胞密度為1×106cells/mL，培養(yǎng)體積根據(jù)傳代或擴(kuò)培的需要進(jìn)行調(diào)整。

1.2.2 葡萄糖濃度的優(yōu)化 依據(jù)BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝情況，以指數(shù)期葡萄糖的比消耗速率（1.07 mmol/109cells·day）和預(yù)期達(dá)到的最高活細(xì)胞密度（2×107cells/mL）進(jìn)行計算，葡萄糖需增加的濃度約為8 mmol/L（公式1）。為避免乳酸過量累積，本節(jié)設(shè)計在初始濃度的基礎(chǔ)上分別增加5 mmol/L和10 mmol/L葡萄糖進(jìn)行考察。

1.2.3 氨基酸濃度的優(yōu)化 依據(jù)BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝情況，對谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化。假設(shè)活細(xì)胞密度和指數(shù)期（D0-D3期間）平均比消耗速率均保持不變，以第3天各氨基酸剩余濃度為初始濃度的30%、45%為準(zhǔn)，算得各氨基酸的推薦增加濃度（表1）。計算公式如下：

表1 氨基酸濃度優(yōu)化的理論添加量

依據(jù)表1推薦的濃度，該部分實(shí)驗(yàn)分別將3種氨基酸按照原濃度增加60%和30%作為兩個濃度水平，高濃度記為“+”，低濃度為“-”，設(shè)計如表2。

表2 氨基酸濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.4 銅鋅離子濃度的優(yōu)化 銅離子、鋅離子分別設(shè)計3個濃度水平進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)設(shè)計如表3所示。

1.2.5 基于搖瓶培養(yǎng)體系的接毒操作 直接接毒：將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時收獲毒液。

表3 銅鋅離子濃度實(shí)驗(yàn)設(shè)計表

接毒前流加補(bǔ)液：將BHK-21細(xì)胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，流加20%濃縮培養(yǎng)基，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時收獲毒液。

接毒前離心換液：將BHK-21細(xì)胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細(xì)胞擴(kuò)增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，離心去上清，使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時收獲毒液。

1.2.6 接毒時設(shè)定不同的活細(xì)胞密度 將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，48 h后取樣計數(shù)，離心更換新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整活細(xì)胞密度分別為3×106cells/mL、6×106cells/mL和9×106cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細(xì)胞病變90%以上時收獲毒液。

1.2.7 BHK-21細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng) 將BHK-21細(xì)胞以1×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種于確認(rèn)無菌的2 L生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積1 L，每24 h取樣計數(shù)。生物反應(yīng)器的操作參數(shù)設(shè)置為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH控制在7.2-7.4，溶氧設(shè)定為40%，表層通氣控制在（50-100）mL/min，堿液使用1 mol/L的Na2CO3溶液。

1.2.8 基于生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系的接毒操作 按照方法1.2.7在2 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，48 h后4℃低溫沉降換液，換液量約80%，按照MOI =0.1接種口蹄疫病毒，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4，接毒6 h后每2 h取樣計數(shù)，待細(xì)胞病變90%以上，收集病毒液于樣品瓶中，-80℃保存。留樣用于測定TCID50和146s含量。

1.2.9 細(xì)胞計數(shù) 使用自動計數(shù)儀（IC1000，Countstar）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并在計數(shù)前添加臺盼藍(lán)染液識別體系中的死細(xì)胞。

1.2.10 代謝物濃度檢測 葡萄糖、乳酸和氨的濃度使用生化分析儀（BP400，Nova）進(jìn)行檢測；氨基酸濃度使用HPLC（1260，Agilent）基于OPA+FMOC在線衍生的方法進(jìn)行檢測。

1.2.11 TCID50的測定 病毒感染半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物的稀釋倍數(shù)常用TCID50進(jìn)行表示，是病毒感染能力的重要指標(biāo)。檢測方法參考文獻(xiàn)方法［20-21］。簡言之，將不同稀釋倍數(shù)的病毒液加入貼壁培養(yǎng)的單層BHK-21細(xì)胞，觀察細(xì)胞的病變情況，并以下式計算TCID50：

其中，L為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數(shù)；D為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數(shù)與病變率低于50%的最低稀釋度對數(shù)之間的差值；S為孔板中病變率的總和。

1.2.12 146s含量的測定 口蹄疫病毒完整粒子146s采用密度梯度離心法進(jìn)行檢測，參考文獻(xiàn)方法［23］。

1.2.13 數(shù)據(jù)處理

（1）比生長速率

μ：比生長速率（day-1）；X2、X1：兩個采樣點(diǎn)的活細(xì)胞密度（cells/mL）；?t：兩個采樣點(diǎn)的間隔時間（day）。

（2）活細(xì)胞密度對時間積分

IVCC：活細(xì)胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

（3）比生成/比消耗速率

Qp：兩個采樣點(diǎn)之間葡萄糖的比消耗速率或乳 酸/氨/氨 基 酸 的 比 生 成 速 率（mmol/（109cells·day））；?p：兩個采樣點(diǎn)之間單位體積培養(yǎng)物中該物質(zhì)的消耗量或生成量（mmol/L）。

（4）細(xì)胞病變率

CPE：BHK-21細(xì)胞被口蹄疫病毒感染后的病變率（Cytopathic effect，%）；Xt：t時刻培養(yǎng)體系中的活細(xì)胞密度（cells/mL）；Xm：細(xì)胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細(xì)胞密度（cells/mL）。

（5）單細(xì)胞產(chǎn)毒能力

Svy：單位細(xì)胞產(chǎn)毒量（Cell-specific virus yield，virions/cell）；146s：口蹄疫病毒完整粒子量（10-6g/mL）；Mv：常數(shù)，單個完整病毒粒子的質(zhì)量，1.146×10-17g/virion；Xm：細(xì)胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細(xì)胞密度（cells/mL）。

（6）數(shù)理統(tǒng)計 文章中的數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行標(biāo)示，組間數(shù)據(jù)對比采用學(xué)生T檢驗(yàn)法，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BHK-21細(xì)胞在P-SFM中的生長和代謝

BHK-21細(xì)胞在P-SFM中進(jìn)行批培養(yǎng)的生長和關(guān)鍵代謝情況如圖1所示。0-2 d是明顯的指數(shù)生長期，平均比生長速率0.96/day，第2-3天比生長速率下降為0.39/day，第3天最高活細(xì)胞密度達(dá)到13.7×106cells/mL并開始下降。培養(yǎng)至第3天時，葡萄糖的濃度為初始濃度的30%左右，不構(gòu)成營養(yǎng)限制，而谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度不足初始濃度的15%（圖1-B），有可能是細(xì)胞生長的限制因素。

如圖1-A所示，0-3 d內(nèi)，乳酸和氨處在持續(xù)積累的狀態(tài)，乳酸最高濃度為26.6 mmol/L，氨為5.02 mmol/L，均已達(dá)到抑制細(xì)胞生長和影響病毒表達(dá)的水平［17，24-25］。有研究結(jié)果表明，不適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分補(bǔ)充［26-27］（如葡萄糖、谷氨酰胺）和一些微量元素（如銅離子［28-29］和鋅離子［30］）會影響細(xì)胞的代謝和產(chǎn)毒過程。因此，針對此款無血清培養(yǎng)基，本研究從葡萄糖、氨基酸（谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺）、微量元素（銅離子、鋅離子）3個方面進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 BHK-21細(xì)胞在P-SFM批培養(yǎng)過程中的生長和代謝情況

2.2 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化

如圖2-A，葡萄糖濃度提高5 mmol/L和10 mmol/L都對細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，兩者之間無顯著性差異，但乳酸的積累也隨葡萄糖濃度的增高而增高。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加量定為5 mmol/L。

氨基酸濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中，以指數(shù)期的細(xì)胞比生長速率和葡萄糖濃度為指標(biāo)時，天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度在較高濃度添加時都顯示了微弱但不顯著的優(yōu)勢。但是乳酸的累積和谷氨酰胺的增加呈正相關(guān)，且具有顯著性差異（圖2-B）。因此，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度分別以“+”、“+”、“-”的水平添加。

銅鋅離子濃度優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖、谷氨酰胺的消耗、乳酸、氨的累積均沒有顯著性差異，而以0-3 d細(xì)胞總IVCC作為指標(biāo)篩選出的最佳銅離子濃度為0.04 mmol/L，鋅離子濃度為0.2 mmol/L，且鋅離子濃度對細(xì)胞生長的影響更為顯著（圖2-C）。

調(diào)整以上成分的濃度后，新的無血清培養(yǎng)基被命名為Opt-SFM。

2.3 BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

搖瓶體系中，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中0-3 d的細(xì)胞總IVCC顯著高于P-SFM組（圖3-A）；Opt-SFM支持細(xì)胞穩(wěn)定傳代，48 h內(nèi)的比生長速率為1.07-1.13/day（圖3-C），傳代過程中細(xì)胞活性始終高于98%；與P-SFM相比，Opt-SFM中的葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率顯著降低（圖3-B）；在Opt-SFM中，細(xì)胞形態(tài)飽滿、尺寸均勻，且結(jié)團(tuán)情況極少（圖3-D）。

圖2 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)化

反應(yīng)器體系內(nèi)，細(xì)胞的生長情況相比搖瓶體系有了更大的提升，如圖4-A所示，細(xì)胞在Opt-SFM中最高活細(xì)胞密度達(dá)到17×106-18×106cells/mL（最高紀(jì)錄為17.8×106cells/mL），與P-SFM相比提高約23.5%；前3 d的葡萄糖比消耗速率和乳酸、氨的比生成速率皆低于P-SFM（圖4-B）。

圖3 基于搖瓶體系，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

圖4 基于反應(yīng)器體系，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中的生長和代謝

2.4 口蹄疫病毒在Opt-SFM中的擴(kuò)增

2.4.1 搖瓶體系中口蹄疫病毒的擴(kuò)增情況 以低血清培養(yǎng)基LSM作為對照，在Opt-SFM中，以任何接毒條件獲得的病毒完整顆粒146s產(chǎn)量和單細(xì)胞產(chǎn)毒能力都高于對照組。如圖5所示，病毒產(chǎn)量隨接毒時細(xì)胞密度升高而升高，接毒細(xì)胞密度9×106cells/mL時，Opt-SFM中146s產(chǎn)量達(dá)到15.45 μg/mL。接毒操作方式上，最優(yōu)選擇是接毒前離心全量換液，流加補(bǔ)液其次，直接接毒所得病毒產(chǎn)量最低；在Opt-SFM中，接毒前離心換液的接毒操作最終得到了14.39 μg/mL的146s病毒產(chǎn)量，單細(xì)胞產(chǎn)毒能力達(dá)到13.95×104virions/mL。

圖5 細(xì)胞密度和接毒方式對病毒產(chǎn)量和單細(xì)胞產(chǎn)毒能力的影響

2.4.2 反應(yīng)器體系中口蹄疫病毒的擴(kuò)增情況 反應(yīng)器體系中，接毒前BHK-21細(xì)胞的密度達(dá)到10.1×106cells/mL，比生長速率為1.14/day，優(yōu)于搖瓶體系，說明細(xì)胞不但達(dá)到了非常高的密度，而且仍處在活躍的指數(shù)生長期內(nèi)。接毒0 h細(xì)胞形態(tài)飽滿、均勻分散（圖6-B）。接毒12 h后細(xì)胞病變率達(dá)到90%以上（圖6-A），計細(xì)胞數(shù)時視野中出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片（圖6-C）。

如圖7，在Opt-SFM中，細(xì)胞病變90%以上收毒后測得毒液的效價為7.25 lgTCID50/0.1mL，與LSM實(shí)驗(yàn)組水平相似，但是在Opt-SFM中獲得的146s含量為15.6 μg/mL，比LSM組提高了50.7%。

3 討論

圖6 BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中接種口蹄疫病毒細(xì)胞生長與病變情況

口蹄疫病毒屬于烈性侵染病毒，一般24 h內(nèi)使宿主細(xì)胞完全病變。作為病毒生產(chǎn)的“工廠”，接毒時BHK-21細(xì)胞的密度和狀態(tài)都與病毒的最終產(chǎn)量有重要的關(guān)系。Maranga等［31］利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)豬細(xì)小病毒樣顆粒（VLPs）時發(fā)現(xiàn)，選擇合適的接毒時間，確保細(xì)胞處于指數(shù)生長期，比選擇細(xì)胞密度高但處于穩(wěn)定期的細(xì)胞更容易獲得較高的產(chǎn)量。本研究中BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中培養(yǎng)48 h時細(xì)胞密度雖已達(dá)到107cells/mL，但仍處于指數(shù)生長期，此時細(xì)胞狀態(tài)健康，細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性高，細(xì)胞產(chǎn)毒能力高，是理想的接毒時間。

圖7 培養(yǎng)基優(yōu)化前后病毒效價TCID50和146s完整病毒顆粒的含量

破除“細(xì)胞密度效應(yīng)”的關(guān)鍵在于營養(yǎng)成分的供應(yīng)和有毒代謝副產(chǎn)物的消除［11-12］。Dill等［15］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系中增加葡萄糖和谷氨酰胺的濃度時均不會影響病毒效價。然而，其文章中考察的葡萄糖濃度最低為22 mmol/L，僅支持最高3×106cells/mL的細(xì)胞密度，按照本文的結(jié)論，支持1.7×107cells/mL的BHK-21細(xì)胞密度僅需要45 mmol/L葡萄糖，因此，Dill等［15］的葡萄糖添加量已經(jīng)超過了細(xì)胞對葡萄糖消耗的需求，成為葡萄糖濃度持續(xù)增加無法引起產(chǎn)量進(jìn)一步提高，反而會導(dǎo)致乳酸大量積累的原因。進(jìn)一步證明了按照細(xì)胞的代謝規(guī)律和細(xì)胞需求進(jìn)行培養(yǎng)基設(shè)計和優(yōu)化的重要性。本研究對無血清培養(yǎng)基中葡萄糖、3種氨基酸和銅鋅離子濃度的設(shè)計均以營養(yǎng)成分的代謝規(guī)律為基礎(chǔ)，滿足細(xì)胞需求的同時，降低細(xì)胞的生長壓力，因此代謝副產(chǎn)物的積累情況不升反降。降低乳酸和氨本身對病毒生產(chǎn)過程影響的同時［16-17］，也降低了因乳酸積累可能引起的pH值降低和滲透壓升高等環(huán)境條件的改變對產(chǎn)毒過程的負(fù)面影響［18-19］。

提高接毒時細(xì)胞密度和改善培養(yǎng)環(huán)境的另一個重要意義在于優(yōu)化接毒操作。搖瓶體系篩選出的接毒前離心換液操作，在生物反應(yīng)器水平實(shí)施時，通常采用低溫沉降的方式，與多數(shù)企業(yè)現(xiàn)行的操作相同，目的是減小培養(yǎng)體系積累的代謝副產(chǎn)物或其他不利因素對產(chǎn)毒過程的干擾［21］。但是，低溫沉降耗時耗力，而且不可避免地會影響細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)而降低其產(chǎn)毒能力。作為可替代的接毒操作方式，接毒前流加補(bǔ)液一定程度上使細(xì)胞維持在穩(wěn)定狀態(tài)，而且減少了換液操作可能引入的染菌風(fēng)險。本文中，BHK-21細(xì)胞在Opt-SFM中接毒前流加補(bǔ)液的操作所獲得的病毒產(chǎn)量高于在LSM中實(shí)施換液后接毒，這一結(jié)果為改良接毒工藝提供了可能性。

采用不含血清和蛋白、化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基進(jìn)行BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和口蹄疫病毒疫苗生產(chǎn)，能夠在提高產(chǎn)能效率的同時降低血清等動物源性添加物的安全風(fēng)險，并減少生產(chǎn)過程中雜蛋白對病毒疫苗純化制劑的壓力［32］。因此，使用無血清懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)病毒疫苗是生物制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢，本研究的成果對于無血清培養(yǎng)基的工業(yè)化應(yīng)用具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的無血清培養(yǎng)基能夠支持BHK-21懸浮細(xì)胞高密度培養(yǎng)和穩(wěn)定傳代，最高活細(xì)胞密度可達(dá)1.78×107cells/mL，培養(yǎng)過程中，乳酸和氨等代謝副產(chǎn)物都維持在較低水平。以1×106cells/mL的接種密度，長至48 h時接毒，相同操作條件下，無血清培養(yǎng)基可獲得與低血清培養(yǎng)基相似的病毒效價（7.25 lgTCID50/0.1mL），而完整病毒粒子146s則達(dá)到了15.6 μg/mL，是低血清培養(yǎng)體系的1.5倍。無血清培養(yǎng)基具有完全替代低血清懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)口蹄疫病毒的潛能。