李夢穎 周華 丁玉春 劉作華 孫靜 李周權(quán)

（1. 西南大學(xué)動物科技學(xué)院 生物飼料與分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都 611130；4. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；5. 重慶市養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；6. 重慶市醫(yī)用動物資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，重慶 402460）

膽汁酸是膽汁的主要功能成分，由肝細(xì)胞中的膽固醇合成，儲存在膽囊，機(jī)體進(jìn)食后釋放到腸道中，由腸道微生物進(jìn)一步代謝。膽汁酸可促進(jìn)食物中脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)許多代謝過程，如葡萄糖、脂質(zhì)和能量代謝的平衡［1］。目前已建立了肝臟中促進(jìn)膽汁酸合成的宿主（人類和小鼠）酶和影響宿主膽汁酸總庫組成的調(diào)節(jié)通路［2-3］，包括由至少17種不同酶催化的多個反應(yīng)步驟［4-5］。根據(jù)膽汁酸的狀態(tài)可分為游離型和結(jié)合型，游離膽汁酸有CA、DCA等，游離膽汁酸以肽鍵形式與氨基酸結(jié)合，成為結(jié)合膽汁酸［6］。根據(jù)膽汁酸形成部位的不同，膽汁酸可以分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。初級膽汁酸由肝臟合成，釋放到腸道中后由腸道微生物將其代謝為次級膽汁酸。膽汁酸既是腸道微生物代謝的底物，又是腸道微生物代謝的產(chǎn)物。腸道微生物對膽汁酸的代謝作用為膽汁酸的多樣性提供了重要的貢獻(xiàn)，具體的代謝作用有去結(jié)合、7α/β-脫羥基化、不同位置羥基的氧化和異構(gòu)化等，將初級結(jié)合膽汁酸代謝為游離次級膽汁酸。腸道微生物對膽汁酸的代謝并不局限于以上所述的去結(jié)合、脫羥基、氧化以及異構(gòu)化反應(yīng)，還包括一些特征不顯著，值得進(jìn)一步研究的修飾過程。產(chǎn)生的膽汁酸作為腸道微生物和機(jī)體相互作用的信號分子，通過膽汁酸受體發(fā)出的信號來影響宿主膽汁酸代謝通路［7］。腸道微生物可以通過改變膽汁酸受體FXR等的表達(dá)來影響膽汁酸的肝腸循環(huán)。例如，膽汁酸肝腸循環(huán)中的幾種合成限速酶，CYP7A1、CYP7B1和CYP27A1均受到腸道菌群的調(diào)節(jié)作用［8］，影響了膽汁酸的產(chǎn)量［4］。

目前，有關(guān)膽汁酸的研究大多集中在小鼠上，但嚙齒類動物與人類的膽汁酸構(gòu)成差異較大，很可能影響膽汁酸受體的信號傳導(dǎo)［9］。因此，將小鼠的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為人類時需要謹(jǐn)慎。相比小鼠，豬在解剖學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)以及大腦發(fā)育等各方面與人類更為相似［10-11］，并且豬體內(nèi)甘氨結(jié)合型膽汁酸比牛磺結(jié)合型膽汁酸多，也與人類相似。因此，豬不僅更適合于模擬人類膽汁酸-腸道微生物-宿主間相互作用，還可以作為研究人類特定代謝疾病的發(fā)生或膽汁酸制劑研發(fā)的動物模型，獲得更可靠的臨床前數(shù)據(jù)。為了最大可能地避免環(huán)境微生物對結(jié)論可靠性的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇無菌（Germ-free，GF）仔豬作為實(shí)驗(yàn)對象，并利用GF豬模型構(gòu)建構(gòu)建豬源糞菌移植（Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）仔豬模型，在相同隔離飼養(yǎng)管理下，利用液相質(zhì)譜（LC-MS）與實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)（qPCR）分析比較腸道微生物對42日齡GF仔豬和FMT仔豬膽汁酸譜和膽汁酸代謝途徑中相關(guān)基因的影響。文中涉及到的膽汁酸如表1所示。

1 材料與方法

1.1 材料

GF、FMT豬模型的制備：選擇血清檢測豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、乙型腦炎病毒、偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、布魯氏菌、豬肺炎支原體、豬流感病毒均為陰性、外觀無異常、良好飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下的妊娠巴馬供體母豬（耳號分別為8005、868、748、884，均來自重慶國家現(xiàn)代畜牧業(yè)示范區(qū)實(shí)驗(yàn)用豬工程中心）進(jìn)行無菌剖腹產(chǎn)術(shù)，獲得無菌新生仔豬模型（模型確認(rèn)方法見孫靜等［12］的方法執(zhí)行）。隨機(jī)選擇11頭無菌仔豬作為本次實(shí)驗(yàn)動物的對象。其中，5頭無菌仔豬始終保持無菌狀態(tài)下飼養(yǎng)（GF組）。剩余6頭無菌仔豬在7日齡時，通過口服豬源糞菌懸液，1 mL/d，連續(xù)服用3 d，制備成糞菌移植模型（FMT組）。所有動物均始終保持在無菌隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。FMT豬的糞便菌群組成：主要細(xì)菌門分類為擬桿菌門（Bacteroidetes，48.69%-77.56%）、厚壁菌門（Firmicutes，18.99%-38.21%）、變形菌門（Proteobacteria，0.93%-15.97%）；主要細(xì)菌屬分類為擬桿菌屬（Bacteroides，1.88%-48.64%）、普雷沃氏菌（Prevotellaceae NK3B31 group，0.02%-56.84%）、瘤 胃 球 菌 屬（Ruminococcus 2，1.24%-13.04%）（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。FMT組仔豬腸道菌群組成與課題組之前的研究相似［13］，也與普通豬的腸道菌群組成相似［14］，證明FMT組仔豬糞菌移植成功。

表1 文中涉及到的膽汁酸名稱

豬源糞菌懸液的制備方法為：動物實(shí)驗(yàn)前1個月，對上述4頭供體豬完成病原篩查后，清晨時收集其新鮮糞便，4℃無菌采樣袋保存，并在超凈臺內(nèi)進(jìn)行糞菌懸液的制備，整個制備過程在樣品采集后1 h內(nèi)完成。糞菌懸液的制備參照孫靜等［15］的方法執(zhí)行。主要操作為：無菌密封勻漿袋內(nèi)，新鮮糞便和滅菌水按照1∶5的比例，混合均勻，再通過4層滅菌醫(yī)用紗布過濾，收集獲得糞便懸液；糞便懸液和滅菌的甘油按照體積比9∶1混合，糞菌懸液中甘油最終濃度為10%，-20℃保存。在使用當(dāng)天，放置室溫回溫，使用前與滅菌奶液按1∶1體積比例混合，通過口服方式轉(zhuǎn)入無菌仔豬體內(nèi)。

動物飼養(yǎng)：GF豬和FMT豬的獲取由子宮剝離器、動物無菌運(yùn)輸器完成，飼養(yǎng)于無菌飼養(yǎng)隔離器內(nèi)，三類隔離裝置均在屏障設(shè)施內(nèi)運(yùn)行，并嚴(yán)格按照屏障設(shè)施的操作規(guī)范執(zhí)行。所有仔豬都給予相同的飼養(yǎng)條件，自由飲水，定量采食，保證兩組仔豬采食相似。每12 h光照-黑暗交替一次。0-21日齡期間，所有實(shí)驗(yàn)豬飼喂滅菌配方乳（滅菌配方乳與滅菌純水按1∶4比例混合）；22-42日齡期間，所有實(shí)驗(yàn)豬飼喂滅菌基礎(chǔ)日糧。飼用前，實(shí)驗(yàn)豬所有配方乳與飼糧均經(jīng)真空包裝、60Co-γ線源輻照滅菌（劑量20 kGy），經(jīng)微生物檢測無菌后，轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)隔離器內(nèi)使用。實(shí)驗(yàn)豬用基礎(chǔ)日糧配方由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所提供（表2）。飲用水為高溫高壓處理后的純水。飲水、配方乳、飼糧標(biāo)本微生物學(xué)檢測方法均參考孫靜等［12］的方法執(zhí)行。

屠宰、采樣與保存：仔豬通過異氟烷呼吸麻醉放血處死后在超凈臺內(nèi)進(jìn)行采樣，確保采樣全程無細(xì)菌污染。收集肝臟、空腸內(nèi)容物、新鮮糞便，液氮速凍后存放于-80℃冰箱，用于膽汁酸的測定；收集肝臟、空腸組織，液氮速凍后存放于-80℃冰箱，用于RNA的提取。

實(shí)驗(yàn)過程中用到的主要試劑藥品：58種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自Steraloids公司（美國）和TRC公司（加拿大）；10種穩(wěn)定同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品購自C/D/N Isotopes公司（加拿大）和Steraloids公司（美國）；乙酸銨（AR級，Sigma-Aldrich，美國）；甲醇、乙腈、異丙醇、冰醋酸、甲酸均購自Thermo-Fisher（LCMS，美國），超純水 Mill-Q（Millipore，美國）；Trizol（Ambion，美 國）；GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒（Promega Corporation，美國），SYBR?Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH plus）（TaKaRa，日本）。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分

1.2 方法

1.2.1 用LC-MS對膽汁酸進(jìn)行定量 靶向代謝組由北京諾和致源質(zhì)譜事業(yè)部完成，分為標(biāo)準(zhǔn)品制備、無膽汁酸基質(zhì)的制備、樣品前處理、LC-MS檢測等步驟。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 準(zhǔn)確稱量68種膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解分別配制濃度為0.5 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為貯備液，將58種膽汁酸貯備液混勻稀釋系列濃度，在空白基質(zhì)（不含膽汁酸的血清）中的系列濃度分別為 2 500、500、250、50、10、2.5、1 nmol/L。在空白基質(zhì)中制備濃度為1 500、150、5 nmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品作為低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣本（QC 樣本）。同位素標(biāo)準(zhǔn)品GCA-d4、TCA-d4、TCDCA-d9、UDCA-d4、CA-d4、GCDCA-d4、GDCA-d4、DCA-d4、LCA-d4和β-CA-d5溶液作為內(nèi)標(biāo)（IS），濃度為150 nmol/L。

1.2.1.2 樣品制備 準(zhǔn)確稱量10 mg樣本，研磨機(jī)預(yù)冷25 mg beads 和 20 μL超純水，樣本用含有10個內(nèi)標(biāo)的180 μL乙腈/甲醇（4∶1）勻漿，13 500 r/min，4℃，離心20 min；去除蛋白沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，在凍干儀中凍干。凍干粉末中加入200 μL的復(fù)溶劑（乙腈∶甲醇=4∶1），13 500 r/min，4℃，離心20 min；上清轉(zhuǎn)移至 96 孔板中進(jìn)行 LC-MS分析，進(jìn)樣體積為5 μL。

1.2.1.3 LC-MS色譜條件 保護(hù)柱：ACQUITY UPLC Cortecs C18 1.6 μmol/L VanGuard pre-column（2.1×5 mm），色譜柱：ACQUITY UPLC Cortecs C18 1.6 μmol/L analytical column（2.1×100 mm），進(jìn)樣量5 μL，柱溫 30℃，流動相：A液-甲酸水（pH3.25），B液-乙腈/甲醇（4∶1），流速0.4 mL/min。

梯度洗脫條件為0-1 min，5% B液；1-3 min，5%-30% B液；3-15 min，30%-100% B液；15-16 min，100%-5% B液；16-17 min，5% B液。

MS條件：電噴霧電離源（ESI），負(fù)離子電離模式。離子源溫度 150℃，Desolvation Temp（℃）：550℃；Desolvation Gas Flow（L/Hr）：1 000。采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進(jìn)行掃描。

1.2.2 qPCR檢測膽汁酸相關(guān)基因的豐度 肝臟和空腸組織樣品總RNA的提取按照Trizol試劑盒操作說明進(jìn)行，提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測得A260/A280值在1.8-2.0，且經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整，RNA降解少。取適量總RNA，根 據(jù)GoScript Reverse Transcription System試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板采用實(shí)時熒光定量PCR方法測定各基因mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增程序設(shè)計(jì)為：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個PCR循環(huán)。每個樣品重復(fù)檢測3次以減少誤差。內(nèi)參基因GAPDH和各基因的引物序列見表3，引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算GF豬和FMT豬各樣品中的基因相對表達(dá)量。采用SPSS中的Welch’st檢驗(yàn)確定GF豬和FMT豬各樣品中膽汁酸譜和基因表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x-±SD表示，P<0.05 為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 GF仔豬和FMT仔豬在相對總膽汁酸水平上的差異

利用LC-MS對同日齡GF仔豬和FMT仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中的相對總膽汁酸水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，仔豬相對總膽汁酸水平在組織間存在明顯差異（P<0.01），表現(xiàn)為空腸內(nèi)容物>膽汁酸內(nèi)容物>糞便。如GF仔豬空腸內(nèi)容物相對總膽汁酸水平為87.31 mg/±56.72 mg/g，約為肝臟（2.63 mg/±0.10 mg/g）的33倍，約為糞便（0.24 mg/±0.19 mg/g）的365倍。定植腸道微生物后的FMT仔豬糞便中的相對總膽汁酸水平約為GF仔豬的4倍（P<0.01，圖1）；FMT豬肝臟相對總膽汁酸水平（1.85 mg/±0.52 mg/g）略低于GF仔豬，F(xiàn)MT豬空腸內(nèi)容物相對總膽汁酸水平（135.50 mg/±63.64 mg/g）略高于GF仔豬，但差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 腸道微生物對各組織膽汁酸譜的影響

2.2.1 GF仔豬和FMT仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中共有膽汁酸的組成和含量比較 GF仔豬和FMT仔豬膽汁酸在肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中檢出的膽汁酸組成完全相同，但含量各異。GF仔豬、FMT仔豬都檢出了50種膽汁酸（圖2）。其中，在肝臟中檢出33種、空腸內(nèi)容物和新鮮糞便樣檢出相同的46種，提示腸道微生物的轉(zhuǎn)入與否不改變仔豬體內(nèi)膽汁酸的種類，但仔豬腸道和糞便中膽汁酸種類高于肝臟組織。此外，結(jié)果顯示了在仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中共有的29種膽汁酸：和GF仔豬相比，18種膽汁酸在FMT仔豬上的相對總水平表現(xiàn)為上調(diào)，如GUDCA（增加13.5倍）、GHDCA（增加54.62倍）和GCDCA（增加3.67倍）。11種膽汁酸的含量在FMT仔豬上的相對總水平表現(xiàn)為下調(diào)（表4），如TCDCA（減少58.43%）、TωMCA（減少20.55%）和THCA（減少68.92%）。結(jié)果提示腸道微生物的轉(zhuǎn)入和定植改變了42日齡仔豬體內(nèi)多種膽汁酸相對總水平。

表3 擴(kuò)增基因的引物信息

圖1 GF仔豬與FMT仔豬各組織膽汁酸水平

圖2 仔豬（GF、FMT組）肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便的膽汁酸種類韋恩分析圖

2.2.2 GF仔豬和FMT仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中的主要膽汁酸 在GF仔豬和FMT仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中分別選取含量最高的10種膽汁酸，分析組織間主要膽汁酸的組成與含量差異。結(jié)果顯示，不同部位的主要膽汁酸豐都差異較大（圖3）。其中，GF仔豬和空腸內(nèi)容物都以THCA、GHCA為主，THCA在GF豬肝臟中的含量在182.04 μg/g-1 968.00 μg/g之間，占總膽汁酸的34.23%；GHCA在GF豬肝臟中的含量在128.76 μg/g-1 292.30 μg/g之間，占總膽汁酸的33.50%。THCA在GF豬空腸內(nèi)容物中的含量在558.84 μg/g-88 332.44 μg/g之間，占總膽汁酸的46.77%；GHCA在GF豬空腸內(nèi)容物中的含量在2 904.47 μg/g-90 813.14 μg/g之間，占總膽汁酸的27.68%。GF豬糞便以CDCA-3Gln、HCA為主，CDCA-3Gln在GF仔豬糞便中的含量在10.14μg/g-297.28 μg/g之間，占總膽汁酸35.32%；HCA在GF仔豬糞便中的含量在0.012 μg/g-256.74 μg/g之間，占28.63%；肝臟和空腸內(nèi)容物的膽汁酸分布較為相似，而糞便膽汁酸與二者差異較大。

表4 FMT仔豬體內(nèi)膽汁酸相對總水平的變化

比較GF仔豬和FMT仔豬組織種各膽汁酸水平差異，結(jié)果顯示：相較于GF仔豬，腸道微生物的定植顯著提高了FMT組仔豬肝臟中的GHDC和HDCA水平，分別增加了19.15倍和15.27倍（P<0.05），降低了TCA（P<0.01）、HCA（P<0.05）、TCDCA（P<0.05）和THCA水平（P<0.05，圖4-A），分別降低了94.90%、68.70%、82.29%和87.71%。而FMT仔豬空腸內(nèi)容物各膽汁酸含量與GF仔豬并無顯著差異，F(xiàn)MT仔豬空腸內(nèi)容中 GCDCA、GUDCA和GLCA略高。相較于GF仔豬，F(xiàn)MT仔豬糞便中初級膽汁酸HDCA水平約提高了650.0倍（P<0.05），次級膽汁酸LCA、αMCA和ωMCA水平顯著提高（P<0.05），分 別 達(dá) 到95.13 μg/g±75.17 μg/g、35.60 μg/g±17.76 μg/g、10.19 μg/g±5.87 μg/g。

2.3 腸道微生物對仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中各類型膽汁酸分布的影響

對GF仔豬和FMT仔豬肝臟中都檢出的33種膽汁酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)按結(jié)構(gòu)可分為14種結(jié)合膽汁酸（8種?；墙Y(jié)合型和6種甘氨結(jié)合型）和19種游離膽汁酸；按其來源可分為14種初級膽汁酸和19種次級膽汁酸。對GF仔豬和FMT仔豬空腸內(nèi)容物和糞便中共同檢出的46種膽汁酸，發(fā)現(xiàn)按結(jié)構(gòu)可分為14種結(jié)合膽汁酸（其中有8種牛磺結(jié)合型膽汁酸和6種甘氨結(jié)合型膽汁酸）和32種游離膽汁酸；按其來源可分為12種初級膽汁酸和34種次級膽汁酸。

圖3 肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中含量最高的10種膽汁酸

圖4 肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中的各膽汁酸水平

研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸在仔豬不同組織中呈現(xiàn)差異性應(yīng)答（圖5）。?；墙Y(jié)合型膽汁酸占總膽汁酸的比例在GF仔豬和FMT仔豬肝臟中分別為48.43%和13.39%（P<0.05）；但FMT仔豬肝臟中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸占總膽汁酸的比例高達(dá)84.72%，高于它在GF仔豬中的比例（48.90%，P<0.05）。FMT仔豬空腸內(nèi)容物中次級膽汁酸占比（17.50%）較GF仔豬空腸內(nèi)容物次級膽汁酸占比（3.22%）顯著增加（P<0.05），增加了約5.4倍。FMT仔豬糞便中初級膽汁酸含量和次級膽汁酸含量分別為0.60 mg/g±0.10 mg/g和0.43 mg/g±0.20 mg/g，高于GF仔豬糞便（0.23 mg/g±0.18 mg/g，0.004 6 mg/g±0.003 5 mg/g），差異達(dá)到極顯著（P<0.01）。此外，F(xiàn)MT仔豬糞便中次級膽汁酸的占比高達(dá)40.07%，約為GF仔豬糞便次級膽汁酸的20.52倍（P<0.01），并以LCA（增加了6 850.7倍，P<0.05）、αMCA（增加了211.92倍，P<0.01）、ωMCA（增加了56.23倍，P<0.01）的變化最為明顯（圖4）。FMT仔豬糞便中結(jié)合型膽汁酸含量為0.002 6 mg/g±0.002 8 mg/g，占總膽汁酸的0.33%，顯著低于GF仔豬（0.078 mg/g±0.056 mg/g，占比51.7%，P<0.05）。

2.4 GF仔豬和FMT仔豬膽汁酸肝腸循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)水平的差異

圖5 各類型膽汁酸占總膽汁酸的比例

研究利用qPCR技術(shù)分析了膽汁酸產(chǎn)生、結(jié)合和再吸收有關(guān)途徑的基因表達(dá)情況。FMT仔豬肝臟中膽汁酸合成關(guān)鍵酶：膽固醇7-羥化酶（Cholesterol 7-alpha hydroxy-lase，CYP7A1）基 因 的表達(dá)量相比GF仔豬下調(diào)（圖6），約為GF仔豬的37%（F=0.37±0.17，P<0.05，表5），而肝內(nèi)細(xì)胞色素P450家族成員27A1（Recombinant cytochrome p450 27A1，CYP27A1）并沒有受到顯著影響。與GF仔豬肝臟相比，F(xiàn)MT組仔豬肝臟中參與膽汁酸結(jié)合氨基酸的膽汁酸輔酶α合酶（Bile acid-CoA synthetase，BACS）基因及其上游調(diào)節(jié)因子肝細(xì)胞核因子4（Hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）的表達(dá)量未受影響。同樣與膽汁酸結(jié)合相關(guān)的酶：膽汁酸氨基酸轉(zhuǎn)化酶（Bile acid transporter，BAT）在FMT仔豬肝臟基因表達(dá)量下調(diào)，僅約為GF仔豬的43%（F=0.43±0.15，P<0.01，表5）。法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）在調(diào)節(jié)膽汁酸合成和體內(nèi)平衡方面起著關(guān)鍵作用，相比于GF仔豬，F(xiàn)MT仔豬肝臟的FXR表達(dá)水平顯著降低，為GF仔豬的48%（F=0.48±0.17，P<0.05），但其下游靶點(diǎn)小異二聚體伴侶（Small heterodimer partner，SHP）和肝受體同系物-1（Liver receptor homolog-1，LRH-1）的基因表達(dá)未受到影響。同樣被視為膽汁酸調(diào)節(jié)器的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor for bile acids，TGR5）在FMT仔豬肝臟中基因表達(dá)量相比GF仔豬下調(diào)，僅為GF仔豬的57%（F=0.57±0.09，P<0.01），而在空腸中基因表達(dá)量未見顯著差異（P>0.05）。雖然FMT仔豬空腸組織中FXR及其分子靶點(diǎn)成纖維細(xì)胞生長因子19（Fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19）基因表達(dá)與GF豬并無顯著差異，但FGF19在FMT仔豬肝臟中的受體基因成纖維細(xì)胞生長因子受體4（Fibroblast growth factor receptor4，F(xiàn)GFR4）和KLOTHO-β（KLβ）相比GF仔豬均下調(diào)，分別為GF仔豬的42%和25%（P<0.01）。與GF仔豬相比，F(xiàn)MT仔豬空腸組織中多耐藥相關(guān)蛋白-2（Multidrug resistance-associated protein-2，MRP2）基因表達(dá)量約為GF仔豬的1.86倍（F=1.86±0.37，P<0.05）。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，F(xiàn)MT仔豬空腸組織中鈉鹽依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Apical sodium-dependent aile acid transporter，ASBT）基因的相對表達(dá)量約為GF仔豬的2.38倍，但由于此次試驗(yàn)個體較少，數(shù)據(jù)變異較大造成差異不顯著（P>0.05）?；讉?cè)轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥蛋白 3（Multidrug resistance-associated protein 3，MRP3）和回腸膽汁酸結(jié)合蛋白（Ileal bile acid binding protein，IBABP）并未受到明顯影響。而肝臟中的其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體（Organic solute transporter α，OSTα）、膽鹽排泌泵（Bilesalt excretory pump，BSEP）、?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）、表達(dá)量組間差異不顯著（P>0.05）。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1（Organic anion transporting polypeptides1，OATP1）在FMT仔豬肝臟中的表達(dá)量是GF仔豬的4.99倍，但由于數(shù)據(jù)變異大而差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

研究利用靶向代謝組比較了相同隔離環(huán)境和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，42日齡GF仔豬和FMT仔豬肝臟、空腸內(nèi)容物和糞便中50種膽汁酸的豐度差異特征，其中空腸內(nèi)容物和糞便中的膽汁酸多樣性較肝臟更高。有研究表明，無菌豬可以利用膽固醇來合成HDCA，常規(guī)飼養(yǎng)（Conventional，CV）豬可以通過腸道微生物的作用來增加HDCA的水平［20］，在本研究中表現(xiàn)為FMT仔豬肝臟HDCA水平較GF仔豬顯著升高。CV豬肝臟游離膽汁酸HCA的含量最高［21］，而GF豬和FMT豬肝臟中以HCA的結(jié)合形式（THCA和GHCA）為主。雖然FMT豬腸道內(nèi)定植的是豬源性糞便微生物群落，但定植效率、供體豬及菌群的選擇、豬種差異、飼養(yǎng)環(huán)境等差異，都可能促成它與CV豬在HCA水平上的差異。此外，F(xiàn)MT仔豬空腸內(nèi)容物和糞便中也發(fā)現(xiàn)了少量的isoLCA，它在人體血清和尿液中非常豐富［22］。

表5 仔豬肝臟與空腸組織中膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平

腸道微生物的存在改變了仔豬的肝臟和糞便的膽汁酸譜。HCA是豬肝臟中合成的最豐富的初級膽汁酸之一［21］，在GF仔豬肝臟中含量為47.61 μg/g±28.12 μg/g；當(dāng)腸道內(nèi)定植微生物后，F(xiàn)MT仔豬肝臟中初級膽汁酸HCA和THCA的含量顯著降低，分別降低了68.70%和87.71%，提示膽汁酸的合成可能受到抑制。這一結(jié)果與FMT組仔豬中觀察到的膽汁酸合成限速酶CYP7A1表達(dá)水平降低表現(xiàn)一致。Kwekkeboom等［23］研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度下的膽汁酸可以通過抑制CYP7A1活性抑制豬肝細(xì)胞的膽汁酸合成，特別是豬膽汁中的GCDCA和GHDCA以及它們的游離膽汁酸（CDCA、HDCA）都能夠顯著抑制CYP7A1的活性。雖然腸道微生物的定植對仔豬肝臟的相對總膽汁酸水平并無顯著影響，但FMT仔豬肝臟中的GHDCA、HDCA的水平都較GF仔豬顯著增加，這可能是FMT仔豬CYP7A1mRNA表達(dá)水平下調(diào)的原因。相較于GF仔豬，F(xiàn)MT仔豬糞便中的總膽汁酸水平更高，提示腸道微生物的存在促進(jìn)FMT組仔豬的膽汁酸排泄，這與小鼠上得到的結(jié)果相似［24］。

圖6 腸道微生物對肝腸循環(huán)中膽汁酸代謝相關(guān)基因的影響

研究顯示，腸道微生物的參與的確提高了仔豬肝臟、腸道內(nèi)容物以及糞便中次級膽汁酸的占比，表明腸道微生物對次級膽汁酸的產(chǎn)生有極其重要的作用。小鼠體內(nèi)，95%以上結(jié)合型膽汁酸為?；墙Y(jié)合型膽汁酸，而人膽汁中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸更為豐富［25］。由于膽汁酸的結(jié)合決定了膽汁酸分子的疏水性和對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的親和性，因此其組分的差異可能會導(dǎo)致物種間膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)的差異［26］。相比小鼠，豬的膽道中甘氨結(jié)合型膽汁酸的占比與人類更加相似［25，27］，更適合于模擬人源菌群特征，研究人類膽汁酸-腸道微生物間互作。與普通豬和人類相仿，F(xiàn)MT豬肝臟和空腸中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸占比更高（分別為84.72%和59.43%），這很可能與仔豬腸道微生物定植相關(guān)。同日齡的GF仔豬空腸中甘氨酸結(jié)合型膽汁酸比例為35.65%，低于?；墙Y(jié)合型膽汁酸，這與Haslewood［20］的研究結(jié)果相似。此外，腸道菌群的轉(zhuǎn)入與定植導(dǎo)致仔豬糞便樣中結(jié)合膽汁酸幾乎被耗盡，僅為0.27%，這很可能是腸道微生物產(chǎn)生的膽鹽水解酶（BSH）的水解作用，去除了甘氨酸和?；撬岬慕Y(jié)合物，生成游離膽汁酸、甘氨酸和?；撬幔?8］，后兩者對腸道微生物具有營養(yǎng)作用［29-30］。由此可知，腸道微生物產(chǎn)生的BSH對膽汁酸池的進(jìn)一步修飾是明顯的，膽汁酸也對腸道微生物的代謝也發(fā)揮了營養(yǎng)作用，二者互相影響，共同調(diào)節(jié)宿主膽汁酸的代謝。

結(jié)果顯示，腸道微生物的轉(zhuǎn)入與定植下調(diào)了肝臟中膽汁酸產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因的表達(dá)。肝細(xì)胞新合成的初級游離膽汁酸通過兩步法形成結(jié)合型膽汁酸，第一步需要BACS催化，第二步需要BAT，形成結(jié)合膽汁酸［31］。腸道微生物的定植下調(diào)了FMT仔豬肝臟中BAT基因的表達(dá)，導(dǎo)致與FMT仔豬肝臟中牛磺結(jié)合型膽汁酸的顯著降低。在膽汁酸的代謝網(wǎng)絡(luò)中，膽汁酸合成酶、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等都需要高度協(xié)調(diào)。FXR是膽汁酸受體，通過SHP實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋，協(xié)調(diào)膽汁酸的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)運(yùn)，在調(diào)節(jié)膽汁酸合成與代謝方面起到關(guān)鍵作用［32］。UDCA是有效的FXR抑制劑。相較于GF仔豬，腸道微生物顯著降低了FMT仔豬肝臟中FXR表達(dá)量，可能與FMT仔豬肝臟中UDCA的提高趨勢相關(guān)。而空腸FXR表達(dá)未受到腸道微生物定植的影響，這與小鼠上的研究結(jié)果不同［24］，可能是由于腸道微生物對空腸膽汁酸譜影響較小的的原因。上述結(jié)果提示，腸道微生物的存在降低了FXR在肝臟中的活性，但對空腸組織影響較小。FMT仔豬肝臟中FXR的下游基因MRP2表達(dá)量隨FXR的降低而降低，MRP2介導(dǎo)膽汁酸從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)至膽小管，腸道微生物的定植減少了肝臟中膽汁酸向膽小管的排出。通過比較GF仔豬和FMT仔豬肝臟中的FXR直接靶基因SHP/LRH1和空腸中的直接靶基因FGF19，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量組間均無顯著差異。但FGF19在肝臟的分子靶體（FGFR4/KLβ）在FMT仔豬肝臟表達(dá)水平顯著低于GF仔豬，分別為GF仔豬的42%和25%。TGR5是膽汁酸的膜受體，與FXR表現(xiàn)一致，在FMT仔豬表現(xiàn)為mRNA水平降低，約為GF仔豬的57%。FMT仔豬和GF仔豬肝臟TGR5的激動劑LCA和DCA［33］的含量組間無明顯差異。

Gunness等［34-35］研究發(fā)現(xiàn)豬腸道中的膽汁酸最高水平大約處于空腸和回腸的交界處，通過對空腸組織膽汁酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行定量。發(fā)現(xiàn)腸道微生物的定植顯著提高了FMT仔豬空腸組織MRP2的mRNA水平，為GF仔豬的1.86倍。MRP2的上調(diào)能夠促進(jìn)膽汁酸進(jìn)入腸腔，可能與糞便高總膽汁酸水平有關(guān)。ASBT是向腸細(xì)胞導(dǎo)入膽汁酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，F(xiàn)MT仔豬腸道ASBT表達(dá)量上調(diào)，為GF仔豬的2.38倍，提示腸道微生物定植后，F(xiàn)MT仔豬空腸細(xì)胞膽汁酸的導(dǎo)入能力增加，降低了空腸膽汁酸的凈轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IBABP和基底外側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3基因表達(dá)并未受其影響，說明腸道微生物的缺失不影響仔豬空腸-血液中的的膽汁酸交流。

4 結(jié)論

通過GF仔豬和FMT仔豬膽汁酸譜和膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平上的比較，結(jié)果證實(shí)了腸道微生物對仔豬膽汁酸代謝有深刻而系統(tǒng)的影響。腸道微生物的轉(zhuǎn)入與定植，不僅在仔豬腸道內(nèi)發(fā)揮作用，也影響了仔豬肝腸系統(tǒng)：腸道微生物的存在增加仔豬的膽汁酸排泄、提高空腸膽汁酸凈轉(zhuǎn)運(yùn)、顯著改變了肝臟、空腸和糞便膽汁酸譜與膽汁酸類型。豬的膽汁酸譜明顯區(qū)別于小鼠，而與人類更相似。物種間膽汁酸譜和膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的差異提示，GF豬適合用于構(gòu)建人源菌群豬模型，研究人類菌群與膽汁酸的互作關(guān)系。