王秀珍，鄒偉，李冀，蔡國(guó)鋒，劉凱，賈坤平，王特哈斯，彭宇飛*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來(lái)，溶栓療法、冠脈搭橋等血管再通技術(shù)被廣泛應(yīng)用于缺血性心肌病導(dǎo)致的急性心肌缺血的治療，隨之而來(lái)的心肌缺血再灌注引起的組織進(jìn)一步損傷一直是臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。心肌缺血再灌注損傷( myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是指在缺血區(qū)恢復(fù)血供后，心肌損傷反而出現(xiàn)進(jìn)一步加重的病理現(xiàn)象[2]。有研究表明最終梗死面積的半數(shù)以上是再灌注損傷造成的[3]，因此,防治MIRI意義重大。研究表明細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等因素都可引起MIRI[4-7]，故單一治療方法療效欠佳。

中醫(yī)藥傳統(tǒng)治療具有多靶點(diǎn)，多方位，多調(diào)控的作用，穩(wěn)心丹主要由尖葉假龍膽、丹參、當(dāng)歸三味藥物組成，已有研究證實(shí)這三味藥均具有抗心肌缺血、抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等心肌保護(hù)作用[8-13]，然三味藥物的組方配伍研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探討穩(wěn)心丹組方對(duì)MIRI大鼠的心肌保護(hù)作用及分子機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

尖葉假龍膽采購(gòu)于內(nèi)蒙古根河市；其余藥物采購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。將尖葉假龍膽、丹參、當(dāng)歸分別用75%乙醇浸泡，提取濃縮液(濃度1 g/mL)按1∶2∶1的比例配伍，根據(jù)成人-大鼠體表面積折算，按總生藥量6 g/kg灌胃。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(黑)2015004。

1.3 主要試劑

CK、LDH試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；LY294002(Selleck)；二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(美國(guó)Sigma公司)；兔抗Akt多克隆抗體、兔抗GSK-3β多克隆抗體、兔抗p-Akt多克隆抗體、兔抗p-GSK-3β多克隆抗體(CST)；兔抗多克隆一抗(武漢博士德)。

1.4 主要儀器

Med Lab型多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組6只。穩(wěn)心丹組、LY294002組給予提取液灌胃14 d；假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃14 d。

2.2 動(dòng)物模型制備

SPF級(jí)SD大鼠術(shù)前禁食，不禁水12 h，腹腔麻醉，連接BL-420S生物系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠心電圖變化，行氣管插管術(shù)，給予輔助通氣(通氣頻率約50次/min)，縱行切開(kāi)胸骨左緣心尖處2～3 cm皮膚，分離肌肉，打開(kāi)胸腔，暴露心臟。用3/0號(hào)無(wú)菌帶針縫合線在左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐旁出針，將冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎。觀察心臟表面顏色，若出現(xiàn)發(fā)紺后立刻送回胸腔并觀察心電圖變化，II導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高或T波高聳，表明心肌缺血形成；30 min后松開(kāi)止血鉗，恢復(fù)再灌注60 min，再灌注損傷成功標(biāo)志以II導(dǎo)聯(lián)上抬的ST段下降50%或高聳的T波下降為準(zhǔn)。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎；LY294002組于再灌注前10 min注射LY294002(濃度0.3 mg/kg)。

2.3 心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

各組大鼠恢復(fù)再灌注60 min后，收集分離血清，按試劑盒要求，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中CK、LDH含量。

2.4 心肌梗死面積

在心臟結(jié)扎線下，將心臟切成厚度約為1～2 mm的薄心肌片，將心肌片置于1%TTC溶液中，剪取蒼白色的梗死心肌稱重，計(jì)算梗死面積百分比(梗死面積/全心重×100%)。

2.5 細(xì)胞凋亡指數(shù)

各組大鼠恢復(fù)再灌注60 min后，迅速取出心臟，取約2 mm×2 mm×2 mm心肌組織，4%多聚甲醛固定，組織包埋，切片機(jī)切片。TUNEL染色，顯微鏡下觀察視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(陽(yáng)性細(xì)胞/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%)。

2.6 Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)蛋白含量檢測(cè)

采用Western blot法，在心肌組織蛋白抽提后經(jīng)RIPA裂解緩沖液將心肌組織細(xì)胞裂解；待樣品冷卻到室溫后，SDS-PAGE蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)膜，蛋白印記，ECL顯色等。GAPDH作為內(nèi)參，采用Bio-Rad軟件進(jìn)行圖片分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 穩(wěn)心丹對(duì)MIRI大鼠血清中心肌酶含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組CK、LDH含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組及LY29002組均能降低CK、LDH表達(dá)，具有顯著性差異(P<0.01)，穩(wěn)心丹組與LY29002組比較，具有顯著性差異(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹能夠明顯降低大鼠血清中心肌酶含量。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組對(duì)MIRI大鼠血清CK、LDH含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖1 各組對(duì)MIRI大鼠血清CK、LDH含量的影響

3.2 穩(wěn)心丹對(duì)MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

模型組梗死面積較之于假手術(shù)組明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組、LY294002組梗死面積顯著降低(P<0.01)；與LY294002組比較，穩(wěn)心丹組梗死面積顯著降低(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹組能夠明顯減少大鼠心肌梗死面積，LY294002組能夠阻滯穩(wěn)心丹對(duì)心肌的保護(hù)作用。見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組對(duì)MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較,▲P<0.01。圖2 各組對(duì)MIRI大鼠心肌梗死面積的影響

3.3 穩(wěn)心丹對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.01)，LY294002組無(wú)顯著性變化(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高(P<0.01)。提示穩(wěn)心丹組能夠降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，但是LY294002組則阻滯了穩(wěn)心丹組的作用。見(jiàn)表3，圖3，圖4。

表3 各組對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

注：與假手術(shù)比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<001；與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖3 各組對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

注:A組：假手術(shù)組;B組：模型組;C組：穩(wěn)心丹組;D組：LY294002組。圖4 各組對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

3.4 穩(wěn)心丹對(duì) MIRI大鼠心肌組織中Akt、p-Akt蛋白含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組p-Akt蛋白水平明顯升高(P<0.01)，LY294002組與之比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組p-Akt蛋白水平明顯降低(P<0.01)。提示LY294002組抑制了Akt的磷酸化。見(jiàn)圖5,表4，圖6。

圖5 各組心肌組織Akt蛋白、p-Akt蛋白表達(dá)

表4 各組心肌組織p-Akt/GAPDH比值變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01;與模型組比較，*P<0.01;與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖6 各組心肌組織p-Akt/GAPDH比值變化

3.5 各組對(duì)MIRI大鼠心肌組織中GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)蛋白含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組中p-GSK-3β(Ser9)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，穩(wěn)心丹組明顯升高了p-GSK-3β(Ser9)(P<0.01)，LY294002組與之比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；與穩(wěn)心丹組比較，LY294002組p-GSK-3β(Ser9)水平顯著降低(P<0.01)。提示LY294002通過(guò)抑制Akt的活化，進(jìn)一步抑制了GSK-3β(Ser9)的活化。見(jiàn)圖7，表5，圖8。

圖7 各組心肌組織GSK-3β蛋白、p-GSK-3β蛋白表達(dá)

表5 各組心肌組織p-GSK-3β/GAPDH比值變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01；與穩(wěn)心丹組比較，▲P<0.01。圖8 各組心肌組織p-GSK-3β/GAPDH比值變化

4 討論

心肌缺血再灌注損傷歸屬于中醫(yī)“胸痹心痛病”范疇。臨床傳統(tǒng)中醫(yī)藥對(duì)本病的治療多從血瘀、痰濁與氣虛等展開(kāi)治療[8]，然“熱化”這一病機(jī)一直未得到現(xiàn)代醫(yī)療工作者的重視。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“熱”與心痛的相關(guān)論述，《素問(wèn)》曰“心熱病者……熱爭(zhēng)則卒心痛”“火熱受邪，心病生焉”，后世《周慎齋遺書》等著作均有發(fā)微。臨床研究證實(shí)胸痹心痛病熱化證比例約為42.18%[9]，胡鏡清等總結(jié)諸多國(guó)醫(yī)大師學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為“瘀熱互結(jié)證”是熱化病機(jī)的四種主要類型之一[10]。穩(wěn)心丹由尖葉假龍膽、丹參、當(dāng)歸組成。尖葉假龍膽在藏族、蒙古族等藥物中有所應(yīng)用，民間稱作“穩(wěn)心草”，蒙藥名為阿古特-其其格，鄂侖春族獵民常用本品代茶飲治療心血管疾病療效顯著。本品具有味苦，性涼，苦以通泄，涼以瀉火，善治心中邪熱所致心悸、心痛。匡海學(xué)等[11]研究表明尖葉假龍膽有效部位可明顯推遲實(shí)驗(yàn)小鼠心律失常出現(xiàn)的時(shí)間及縮短心律失常持續(xù)時(shí)間。李冀等[12]實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)尖葉假龍膽醇提液能夠明顯升高M(jìn)IRI大鼠血清中6-酮-PGF1α的含量，降低TXB2的含量。丹參味苦、性微寒，入心、肝經(jīng)，活血化瘀，止心痛。王明樂(lè)[13]提出丹參提取物能夠明顯降低大鼠心肌酶含量，降低氧化應(yīng)激因子表達(dá)。當(dāng)歸味甘，性辛溫，入心、肝、脾經(jīng)，補(bǔ)血活血，止痛。上官海娟等[14]研究表明當(dāng)歸可抑制細(xì)胞凋亡因子(Bax/Bcl-2)的表達(dá)，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。陳彥文等[15]研究證實(shí)大劑量當(dāng)歸水煎液能夠明顯減少大鼠心肌梗死面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡。以上三味藥物在實(shí)驗(yàn)研究中均證實(shí)對(duì)心肌具有保護(hù)作用，但是組方配伍研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，故本課題基于瘀熱互結(jié)之胸痹心痛病之病機(jī)，確立“清熱活血化瘀”治則，尖葉假龍膽清心瀉火而除煩；丹參活血化瘀，止心痛；尖葉假龍膽、丹參性味較為苦寒，配伍當(dāng)歸佐制兩者的苦寒之性。如此三者配伍，涼血化瘀止痛。

本課題研究結(jié)果顯示MIRI發(fā)生后血清中CK、LDH含量明顯升高，心肌梗死面積增大；穩(wěn)心丹能夠降低血清中CK、LDH含量，減少心肌梗死面積，而LY294002組則阻斷了穩(wěn)心丹的這一心肌保護(hù)作用。

PI3K/Akt是介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要信號(hào)通路，在細(xì)胞因子及激素等胞外信號(hào)作用下可激活下游激酶Akt，Akt是該信號(hào)通路的核心環(huán)節(jié)，有研究結(jié)果顯示加入Akt特異性阻滯劑抑制Akt的活性時(shí)心肌細(xì)胞的收縮功能明顯下降[16]。Akt激活后可作用于下游的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)等靶點(diǎn)，GSK-3β主要具有促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)，維持細(xì)胞骨架的作用，GSK-3β的活性及磷酸化程度與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系[17]，GSK-3β的失活會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)放，細(xì)胞凋亡發(fā)生。GSK-3β有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)：酪氨酸216(Tyr216)及絲氨酸9(Ser9)，Tyr216位點(diǎn)磷酸化能夠增加GSK-3β的活性，而Ser9位點(diǎn)的磷酸化則降低GSK-3β的活性?；罨腁kt磷酸化Ser9使GSK-3β被磷酸化，致使活性被抑制，導(dǎo)致其對(duì)下游因子的調(diào)控能力喪失，最終導(dǎo)致mPTP的開(kāi)放，細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。研究證實(shí)活化的Akt能夠使GSK-3β磷酸化，抑制mPTP開(kāi)放，抑制凋亡因子細(xì)胞色素c釋放，減少線粒體損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[19]。有研究證實(shí)LY294002它能夠特異性阻止PI3K下游底物的產(chǎn)生，導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路失活[20]。

本課題進(jìn)一步研究結(jié)果表明穩(wěn)心丹能夠明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；上調(diào)p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)，在加入PI3K特異性阻滯劑LY294002后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯上升，p-Akt及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)明顯降低，由此提示穩(wěn)心丹抗MIRI的作用可能與激活PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本課題證實(shí)穩(wěn)心丹能夠通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本課題將為道地藥材的推廣提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，我們后續(xù)將對(duì)穩(wěn)心丹調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體凋亡的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。