張奉海，張瑞榮，陳淑娟，王金紅，于永蘭

(山東省日照市莒縣中醫(yī)醫(yī)院,山東 日照 276500)

紫杉醇(paclitaxel，Taxol)是從中藥紅豆杉中提取的抗腫瘤活性成分，在抗腫瘤方面具有顯著的療效[1]，可有效抑制癌細(xì)胞的增殖擴(kuò)散，在多種癌癥的治療上取得了一定的療效，但是其潛在的不良反應(yīng)及耐藥性使得紫杉醇的使用受到了一定的限制[2]。人參皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3，GS-Rg3)，是從中藥人參中提取的單體，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤的作用，目前人參皂苷Rg3對(duì)胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、大腸癌等腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)研究較多，但是對(duì)于人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇治療肝癌方面的研究較少[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇抗肝癌的體內(nèi)外研究，初步探討兩藥聯(lián)合是否具有協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞的作用，為臨床應(yīng)用人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇治療肝癌提供基礎(chǔ)理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑

人參皂苷Rg3(瑞錦生物技術(shù)有限公司，純度>99%，批號(hào)JZ15110202)；紫杉醇(山東博科生物，純度>98%，批號(hào)A0820a)；DMEM (山東博科生物，批號(hào)20170521)；MTT(山東博科生物，批號(hào)20180607)。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)LHH.CP-250-Q)；倒置顯微鏡(上海精密儀器儀表公司，型號(hào)XDS-1A)；H2050R臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；暗盒(上海百研生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物及細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)研究所)；無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)BALB/cA-nu裸鼠40只，體質(zhì)量(100±20)g，購(gòu)于山東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基，并加入1%青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1～2 d更換培養(yǎng)基1次，每2～3 d加入胰酶進(jìn)行消化，傳代。

2.2 人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤

取“2.1”項(xiàng)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在低速離心機(jī)(1 000 r/min，5 min)上離心，制成濃度為1×106/mL的混懸液。蘸取碘伏消毒裸鼠右腋下部位，使用1 mL一次性無(wú)菌注射器抽取0.2 mL混懸液注入此處皮下，5～7 d內(nèi)即可觸及皮下有結(jié)節(jié)，2周左右可見腫瘤形成，選擇瘤體直徑為(65±5)mm的裸鼠移植瘤模型納入下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 分組及給藥

將造模成功的40只裸鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組,生理鹽水0.2 mL，灌胃；人參皂苷Rg3組,GS-Rg3:10 mg/(kg·d)，灌胃；紫杉醇組,Taxol：10 mg/kg，腹腔注射，每周2次；聯(lián)合組，GS-Rg3+Taxol，給藥劑量和方法同上。每組10只，給藥3周后，頸椎脫臼處死，分離瘤體組織。

2.4 抑瘤率

取“2.3”項(xiàng)分離的瘤體組織，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積(V)、相對(duì)腫瘤體積(RTV)及相對(duì)腫瘤抑制率(T/C)。具體計(jì)算方式[6]如下：

腫瘤體積(V)=(a×b2)/2

相對(duì)腫瘤體積(RTV)=Vt/ V0

相對(duì)腫瘤抑制率(T/C)=(1-TRTV/ CRTV)×100%

其中a為腫瘤的最長(zhǎng)直徑，b為垂直于a的最短直徑；V0為首次給藥前的腫瘤體積；Vt為每次測(cè)量的體積；TRTV為給藥組的相對(duì)腫瘤體積；CRTV為對(duì)照組的相對(duì)腫瘤體積。

2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖

將肝癌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、人參皂苷組(10、20、40、80、100 μg/mL)、紫杉醇組(80 μg/mL)、聯(lián)合組給藥劑量同上；調(diào)整各組細(xì)胞至合適濃度，接種于96孔板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、96 h后，每孔細(xì)胞加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，每孔加入200 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)細(xì)胞在570 nm的吸光值。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

加入裂解液，提取總蛋白，測(cè)定其濃度，并與適量上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱10 min，變性；將配置好的聚丙烯酰胺凝膠放入電泳槽，加入電泳液，微量移液器吸取40 μg總蛋白加入上樣孔中，電泳至藍(lán)色條帶分離后調(diào)整電壓，待藍(lán)色條帶到達(dá)凝膠底部，切斷電源，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜浸泡與甲醛中，然后在預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中處理5 min，將PVDF膜與凝膠貼合，不要產(chǎn)生氣泡，兩側(cè)覆蓋濾紙，轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后將PVDF膜浸泡與5%的脫脂奶粉溶液中，促進(jìn)非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉；根據(jù)抗體說(shuō)明書稀釋抗體，與PVDF膜4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃水浴復(fù)溫1 h，TBST漂洗2次，每次5 min，加入二抗，37 ℃孵育PVDF膜2 h，TBST漂洗2次，每次5 min，避光，加入ECL液孵育5 min，凝膠成像儀中拍照，Quantity One分析蛋白質(zhì)灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

MTT結(jié)果如表1 所示，人參皂苷Rg3(10、15、30、60、120 μg/mL)聯(lián)合紫杉醇(80 μg/mL)分別處理肝癌HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)其增殖作用均有不同程度的抑制作用。與24 h處理組比較，紫杉醇聯(lián)合人參皂苷Rg3(30、60 μg/mL)在48、72 h后對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用顯著升高(P<0.05)；與48 h處理組比較，紫杉醇聯(lián)合人參皂苷Rg3(30、60、120 μg/mL)在72 h后對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同劑量人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2各時(shí)間點(diǎn)的MTT結(jié)果

3.2 人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤體內(nèi)抗腫瘤作用

各實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況和腫瘤抑制率分別見圖1和圖2。由圖可見，相比于對(duì)照組，給予不同藥物處理均可抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，其中聯(lián)合給藥組抑制作用最為明顯。由圖2可以看出，在給藥14 d后，人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇組腫瘤抑制率(64.13±2.02)%較人參皂苷Rg3組(48.34±3.86)%和紫杉醇組(54.21±3.21)%顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在給藥28 d后，聯(lián)合組腫瘤抑制率(69.38±2.19)%較人參皂苷Rg3組(57.30±3.95)%和紫杉醇組(61.08±4.16)%顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤腫瘤體積

注：與人參皂苷Rg3組比較，*P<0.05,**P<0.01；與紫杉醇組比較，P<0. 05。圖2 人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

3.3 人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、bac-2/bax表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，與對(duì)照組比較，聯(lián)合用藥組人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，聯(lián)合用藥組和紫杉醇組bac-2/bax表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 討論

肝癌又稱肝惡性腫瘤，是常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌患者死亡率約10萬(wàn)人/年，僅居食管癌和胃癌之后，其年死亡率占全世界肝癌死亡率的45%，如果不及時(shí)給予救治，生存期僅0.7～8個(gè)月[7-9]。肝癌手術(shù)后期的治療多以放化療為主，紫杉醇為常見廣譜化療藥物[10-11]，與其他化療藥物一樣，紫杉醇在用于肝癌治療過(guò)程中，除殺死肝癌細(xì)胞外，還會(huì)影響機(jī)體的正常細(xì)胞甚至致其死亡[12-14]。因此，研究更多替代或者輔助化療的藥物，從而起到減毒增效的作用是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[15-16]。

注：A：caspase-3、bcl-2、bax蛋白免疫印跡條帶；B：caspase-3、bcl-2、bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分析；C：bcl-2/Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分析。與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與紫杉醇組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖3 人肝癌裸鼠移植瘤caspase-3、bac-2/bax蛋白表達(dá)水平變化的免疫印跡分析

本研究選用人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)考查其聯(lián)合肝癌的作用。通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合可顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，與單用紫杉醇相比，其抑制作用更加明顯，而抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系，當(dāng)給藥濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，其抑制作用趨于平穩(wěn)，這與鄭展等人[17]研究的結(jié)果一致。此外，通過(guò)作用于裸鼠移植瘤肝癌模型，發(fā)現(xiàn)隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇對(duì)于體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)也具有顯著的抑制作用。為了從多方面探究?jī)伤幝?lián)合抗肝癌的作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、bcl-2/bax的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，聯(lián)合給藥組caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，bcl-2/bax顯著降低，推測(cè)人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇可通過(guò)caspase-3、bcl-2/bax信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，人參皂苷Rg3聯(lián)合紫杉醇可通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡達(dá)到協(xié)同抗腫瘤的效果，但是肝癌的形成、生長(zhǎng)、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，不單與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)，其他方面的作用還有待進(jìn)一步研究。