杜 崴，李 森，公菲菲，劉 娟，高 陽，熊 雄，王金耀，亢秀萍

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/山西省設(shè)施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷，030801； 2. 大同黃花產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，山西 大同，037004）

黃花菜（Hemerocallis citrina），萱草屬多年生草本植物，具有很高的觀賞價值，其花蕾具有多種藥用功能，可食用，是我國特色蔬菜之一［1］。‘大同黃花’是山西大同區(qū)域主栽的黃花菜地方品種，被列為國家地理標(biāo)志保護產(chǎn)品。黃花菜單朵花期僅1 d，同一種質(zhì)在不同經(jīng)緯度地區(qū)的開花存在差異，但都具有明顯的夜開晝閉的節(jié)律特征，是研究開花節(jié)律的模式植物。植物開花節(jié)律受多種開花途徑的共同影響，在模式植物擬南芥中已明確有光周期途徑、自主途徑、赤霉素途徑、春化途徑及年齡途徑5 條開花信號途徑［2-4］，這5 條途徑共同作用于生物鐘中央振蕩器，構(gòu)成了復(fù)雜的開花節(jié)律調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［5-6］。

有研究表明，牽牛、曇花、月見草和夜來香等植物的開花節(jié)律均受到不同光/暗時長的調(diào)控［7］，從光照轉(zhuǎn)變?yōu)楹诎祷蛘邚暮诎缔D(zhuǎn)變?yōu)楣庹站鶗淖冎参锏拈_花節(jié)律［8］。光周期對開花節(jié)律的影響最早是在煙草突變體中發(fā)現(xiàn)的，且不同植物開花節(jié)律和光周期途徑在很大程度上具有保守性［9］。睡蓮可通過延長光周期促進提前開放，而光周期縮短則導(dǎo)致睡蓮花開閉節(jié)律的縮短［10］。植物通過感知晝夜長度變化，使外源光周期信號與開花生物鐘之間形成復(fù)雜的互作，從而引起一系列開花基因的激活或抑制，最終導(dǎo)致開花節(jié)律的改變［11］。除外源光照條件，植物內(nèi)源碳水化合物也對植物開花節(jié)律具有調(diào)節(jié)作用［12］。

CONSTANS (CO)基因是擬南芥光周期途徑中的關(guān)鍵基因，它通過誘導(dǎo)FLOWERING LOCUS T (FT)、SUPPRESSOR OF OVEREREXPRESSION OF CONATANS 1 (SOC1)等下游基因的轉(zhuǎn)錄表達促使植株開花［13］，而其表達水平及蛋白穩(wěn)定性受外界光周期和生物鐘的調(diào)控。目前CO 家族相關(guān)基因在許多植物中已被克隆，CO 家族共有17 個成員，它們在N 端具有高度保守的B-box 型鋅指結(jié)構(gòu)，C 端則含有一個CCT 結(jié)構(gòu)域［14］。CO 家族基因在功能上存在差異，在擬南芥中COL1 和COL2 表達受生物鐘調(diào)控，但在調(diào)節(jié)開花上未起到顯著作用［15］，COL3 過表達可延遲擬南芥開花，同時還促進側(cè)根的發(fā)育與芽的伸長［16］。在大豆中，基因COL2 對開花節(jié)律無顯著影響，而COL5 則可促進開花［17］。月季中CO 基因可以激活FT 的表達，促進植株對光周期的響應(yīng)而提前開花［18］。

為探索不同光周期對黃花菜開花節(jié)律的影響，明確黃花菜開花過程中CO 家族相關(guān)基因的功能，豐富黃花菜開花調(diào)控機制，本研究以‘大同黃花’為材料，跟蹤觀察不同光周期下黃花菜開花過程，并測定碳水化合物含量，對光周期開花途徑基因HcCOL14 進行克隆及表達特性分析，為深入研究CO 基因在黃花菜光周期開花途徑中的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取‘大同黃花’（Hemerocallis citrina cv.‘DatongHuanghua’）作為試驗材料，材料栽培于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站萱草屬植物種質(zhì)資源圃。

1.2 不同光周期處理及開花節(jié)律觀察

1.2.1 晝夜顛倒試驗 將盆栽的‘大同黃花’在抽薹現(xiàn)蕾后轉(zhuǎn)移到兩個培養(yǎng)室內(nèi)，在其外部進行遮光處理，兩個培養(yǎng)室補光燈的時間設(shè)置為：對照為5:00開，21:00 關(guān)；處理為 17:00 開，9:00 關(guān)。同時將‘大同黃花’帶有花蕾的花葶從基部剪下來插在裝有水的瓶子里，放在2 個培養(yǎng)室內(nèi)，每天換1 次水并修剪花葶基部。使用360 智能攝像頭對單朵花進行實時監(jiān)測，記錄其開口時間點（即花瓣和花萼都打開，雌蕊雄蕊同時出現(xiàn)在花瓣中間［19］）。

1.2.2 大田不同光周期處理試驗 根據(jù)山西省晉中市太谷區(qū)7 月光周期條件（5:00 由黑暗期進入光照期、20:00 由光照期進入黑暗期），用不同遮光材料（黑布、黑白膜）對‘大同黃花’整株進行遮光處理，設(shè)置3 個不同的晝/夜時長處理，分別為：處理1，于開花前1 天20:00 時進行遮光，次日8:00 除去遮光材料，形成晝/ 夜時長12/12 h（8:00—20:00 光照/20:00—8:00 黑暗）光周期條件；處理2，于開花前1 天20:00 時進行遮光，次日10:00 除去遮光材料，形成晝/夜時長10/14 h（10:00—20:00 光照/20:00—10:00 黑暗）光周期條件；處理3，于開花前1 天20:00 時進行遮光，次日12:00 除去遮光材料，形成晝/夜時長8/16 h（12:00—20:00 光照/20:00—12:00 黑暗）光周期條件。利用自然光照下晝/夜時長15/9 h（5:00—20:00 光照/20:00—5:00 黑暗）作為對照。除晝夜時長不一外，其他環(huán)境條件盡量保持一致。自當(dāng)日17:00 起，使用360 智能攝像頭對單朵花進行實時監(jiān)測，觀察并記錄其開口時間點。

1.2.3 不同組織部位遮光處理試驗 用黑布對‘大同黃花’葉片進行全天遮光處理，用黑色遮光袋對整個花序進行全天遮光處理，每天17:00 起每隔 15 min 對當(dāng)天將要開放的花朵進行觀察。

1.2.4 花器官不同光周期處理試驗 用黑色遮光袋于開花前1 天對‘大同黃花’的整枝花序和單蕾分別進行不同光周期遮光處理，晝/夜時長處理為15/9 h、12/12 h、10/14 h、8/16 h（處理方式與整株不同光周期處理試驗相同）。使用360 智能攝像頭進行實時監(jiān)測，記錄開口時間點。

1.3 碳水化合物含量測定

對黑白膜整株處理的‘大同黃花’在開口前后6 h 及各處理開口時間點的樣品進行統(tǒng)一采集，由于8/16 h 晝/夜處理下‘大同黃花’開口時間不穩(wěn)定，故僅選取15/9 h（CK）、12/12 h、10/14 h 處理下的開口時間點作為采集時間，并選取8/16 h 與10/14 h 同一時間開口樣品進行采集。對采集樣品中碳水化合物含量進行測定，其中淀粉測定采用蒽酮比色法，果糖、蔗糖測定采用間苯二酚法［20］。

1.4 光周期途徑核心基因CO 的篩選

從黃花菜和萱草花器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挖掘光周期途徑核心基因CO，使用TBtools 繪制熱圖分析各基因表達水平。利用ExPASy（https://web.expasy.org/translate/）對CO 家族相關(guān)基因核苷酸序列編碼的氨基酸序列進行預(yù)測，基于氨基酸序列利用在線分析工 具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/ save_user_preferences.pl）完成保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.5 HcCOL14 基因克隆與表達特性分析

本研究選取CO 家族中在2 組樣品間表達水平差異倍數(shù)較大的Unigene0000694 進行基因克隆和熒光定量驗證。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中Unigene0000694 的參考序列，在UTR 區(qū)設(shè)計特異性擴增引物cCO- F 和cCO-R，以黃花菜開花后2 h（20:00）樣品的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。RNA 的提取、cDNA 反轉(zhuǎn)錄程序、PCR 擴增條件、產(chǎn)物回收及T載的連接方法同公菲菲［21］，連接后送北京華大基因進行Sanger 測序。得到序列后使用DNAMAN 與參考序列比對，在ExPASy 將核苷酸序列轉(zhuǎn)換氨基酸序列后在NCBI-blastp 進行同源性比對，并利用MEGA5.0 將該蛋白與擬南芥的17 個CO-like 蛋白進行進化樹分析。

由于單蕾遮光處理的開口時間較穩(wěn)定，且與整枝花序遮光處理開口時間基本一致，本研究對單蕾遮光處理樣品進行表達特性分析。根據(jù)克隆序列設(shè)計實時熒光定量引物qCO-F、qCO-R，見表1。以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 第一鏈經(jīng)稀釋后作為模板，選用AP4 作為內(nèi)參基因［22］，使用Applied Biosystems 7500 型 定 量PCR 儀， 采 用TaKaRa 公 司 的TB Green? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) 試 劑盒，進行實時熒光定量試驗。RT-qPCR 反應(yīng)條件及反應(yīng)程序同公菲菲［21］。使用Microsoft Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列名稱及說明Table 1 Primer sequence name and description

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光周期下‘大同黃花’的開花節(jié)律

對‘大同黃花’進行晝夜顛倒處理后，發(fā)現(xiàn)其開口時間與正常光周期處理下相差約12 h。其中在土培條件下，晝夜顛倒后約7 d 時間可將‘大同黃花’開口時間由17:00 調(diào)整為7:30。而瓶插條件下約4 d時間就可使開花時間穩(wěn)定在6:30 左右（表2）。

在大田分別用黑布、黑白膜對‘大同黃花’進行遮光處理，各處理下‘大同黃花’開口時間如表2 所示。由表可知，用黑布對整株進行處理時，各光周期處理下‘大同黃花’開口時間差異顯著，其中晝/夜時長8/16 h 比15/9 h 光周期處理下開口時間晚約3 h。用黑白膜進行整株處理時，晝/夜時長15/9 h、12/12 h 和10/14 h 處理下開口時間依次延遲1 h 左右，而8/16 h 光周期處理下‘大同黃花’開口時間表現(xiàn)出不穩(wěn)定。

表2 不同光周期處理下開花節(jié)律Table 2 Flowering rhythm under different photoperiod treatments

基于前2 種遮光材料光周期處理結(jié)果，通過對‘大同黃花’不同組織部位進行遮光處理，發(fā)現(xiàn)對葉片進行遮光后開口時間未發(fā)生變化，而對花蕾進行遮光時‘大同黃花’開口時間顯著延遲，由此得出花蕾是黃花菜光周期開花響應(yīng)關(guān)鍵部位。于是采用黑色遮光袋對整枝花葶進行遮光處理，自然光周期下開口時間在18:00，晝/ 夜時長12/12 h、10/14 h、8/16 h 處理下開口時間依次延遲約1 h。進一步，用黑色遮光袋進行單蕾遮光處理，發(fā)現(xiàn)其開口時間基本與對整枝花葶進行遮光處理時一致。在各材料的光周期處理下，‘大同黃花’開口時間大部分均表現(xiàn)出穩(wěn)定。

以上結(jié)果表明，花蕾是‘大同黃花’開花生物鐘的重要響應(yīng)部位，光周期的改變會影響‘大同黃花’開花節(jié)律，證明光周期在‘大同黃花’開花調(diào)控中起著重要的作用。

2.2 不同光周期下‘大同黃花’碳水化合物含量的變化

對不同光周期下‘大同黃花’開花過程中碳水化合物含量進行測定，結(jié)果如圖1 所示。由圖可知，開花過程中不同光周期處理下‘大同黃花’糖含量均表現(xiàn)為：蔗糖＞果糖＞淀粉。在CK（15/9 h）開口前6 h（12:00）不同光周期處理下‘大同黃花’果糖含量均有微弱差異，晝/夜12/12 h 處理果糖含量最高，10/14 h 與8/16 h 處理果糖含量差別不大。在18:00—24:00 各處理開花過程中果糖含量變化不明顯，且含量較為接近。除CK 外各處理在24:00時果糖含量均低于12:00 時。在不同光周期處理下‘大同黃花’蔗糖和淀粉含量變化趨勢基本一致，在12:00 時蔗糖和淀粉含量均保持較高，12:00—18:00 時迅速下降，之后緩慢下降至各處理開口時間點后含量小幅上升，最終保持在小范圍內(nèi)波動。

2.3 光周期途徑核心基因CO 的篩選

在光周期開花途徑中，高等植物可以通過感知外部環(huán)境的光周期變化及光照時間等信號，來調(diào)節(jié)植物內(nèi)部基因的表達模式，從而調(diào)控開花節(jié)律。CONSTANS (CO)基因是光周期途徑中監(jiān)測晝夜長度的重要元件，在開花基因和生物鐘之間發(fā)揮著重要作用。在黃花菜和萱草花器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共篩選到27 個CONSTANS-like(COL) 家族相關(guān)基因，使用TBtools 繪制熱圖分析各基因表達水平，運用SMART 程序在線預(yù)測COL 家族相關(guān)基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，如圖2 所示。分析發(fā)現(xiàn)Unigene0000694 基因在兩組樣品間差異倍數(shù)最大，且序列結(jié)構(gòu)較完整，N 端具有高度保守的B-box 結(jié)構(gòu)域，C 端含有1 個CCT 結(jié)構(gòu)域。故推測該基因可能在黃花菜光周期開花調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。

圖1 不同光周期處理下碳水化合物含量變化Fig.1 Changes in carbohydrate content under different photoperiod treatments

圖2 CO 家族相關(guān)基因表達水平及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Expression level and conserved domain analysis of CO family genes

2.4 HcCOL14 基因的克隆

由上述結(jié)果可知Unigene0000694 基因在2 組樣品間差異倍數(shù)最大，且序列結(jié)構(gòu)較完整。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中COL14 基因的參考序列，在UTR 區(qū)設(shè)計特異性擴增引物cCO-F 和cCO-R，以黃花菜開花后2 h（20:00）樣品的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5% TAE 瓊脂糖凝膠電泳分離，見圖3?？寺〉玫紺OL14 基因的cDNA 全長共計1 588 bp，利用NCBI-ORF Finder 分析CO 基因編碼區(qū)，其片段長1 422 bp，編碼473 個氨基酸。由NCBICD Search 預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域可知，在蛋白序列的N端有1 個Bbox1_BBX-like 保守結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸序列的17 ～60 位點，在60 ～85 位點也存在1個B_box_SF super family，且C 端具有1 個CCT 結(jié)構(gòu)域 ，位于序列的422 ～464 位點，該蛋白具有典型CONSTANS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)。經(jīng)過NCBI-blastp進行序列比對（表3），Unigene0000694 與AoCOL-14(XP_020261158.1)、AoCOL-14(XP_020248360.1)、E g C O L-1 4(X P_0 1 0 9 0 7 0 7 8.1)、P d C O L-13(XP_008801132.1) 編碼的蛋白同源性比較高，擁有相同保守域，同時將Unigene0000694 的氨基酸序列與擬南芥的17 個CO-like 蛋白進行進化分析，圖4 顯 示Unigene0000694 與AtCO14 和AtCO15 聚 為 1 支屬于Group Ш，將本基因命名為HcCOL14 基因，與轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果一致。

圖3 HcCOL 基因PCR 擴增及CDS 序列和其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 The results of PCR product and CDS sequence and derived amino acid sequence of HcCOL gene

表3 Unigene000694 氨基酸序列NCBI-blastp 部分結(jié)果Table 3 NCBI-blast partial results of Unigene000694 amino acid sequence

圖4 Unigene000694 與擬南芥CO-like 蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Unigene000694 and Arabidopsis CO-like protein

2.5 光周期基因HcCOL14 的表達特性分析

CONSTANS (CO) 基因在光周期途徑中起著核心調(diào)控因子的作用。對4 種不同光周期處理下‘大同黃花’開花過程中CO 家族相關(guān)基因HcCOL14進行表達特性分析，結(jié)果如圖5 所示。由圖可知在12:00—19:00 時HcCOL14 基因在4 種光周期處理下表達量均保持上升。在19:00—24:00 時12/12 h 和CK(15/9 h) 2 種光周期條件下HcCOL14 具有相似表達規(guī)律，即在20:00 前表達量持續(xù)上升，在進入黑暗時（20:00）出現(xiàn)峰值后表達量出現(xiàn)波動。而10/14 h 晝/夜處理則剛好相反，在19:00 時HcCOL14 表達量下降，于20:00 后開始上升并在21:00 時達到峰值。8/16 h 晝/夜處理在20:00 前表達量逐漸上升，20:00 達到峰值后逐漸下降。

圖5 不同光周期處理下HcCOL14 基因的表達分析Fig.5 Expression analysis of HcCOL14 gene under different photoperiod treatments

3 結(jié)論與討論

在植物的生命周期中，開花不僅是生殖過程的重要組成部分，還是一個易受環(huán)境條件影響的關(guān)鍵發(fā)育階段。光周期是直接影響植物開花的主要環(huán)境因素之一，植物通過感知光周期變化來調(diào)節(jié)開花節(jié)律［23］。本研究首次對‘大同黃花’不同部位進行遮光處理，并且對不同光周期下‘大同黃花’開口時間進行觀察，發(fā)現(xiàn)‘大同黃花’的花蕾為光周期重要響應(yīng)部位，花蕾可通過感知外界光/暗變化從而改變開花節(jié)律。有研究表明當(dāng)睡蓮的光周期從晝/夜時長16/8 h（7:00—23:00 光照/23:00—7:00 黑暗）改變?yōu)?2/12 h（9:00—21:00光照/21:00—9:00黑暗）時，其開花節(jié)律由7:00—10:00—14:00—18:00 調(diào) 整 到9:00—10:00—12:30—17:00［24］。本試驗證明在一定范圍內(nèi)縮短光周期可延遲開花，與該研究結(jié)果一致。牽牛的開花也受花前光/暗條件的影響，在8 h 或12 h 黑暗期后開花節(jié)律保持穩(wěn)定，但在僅4 h 黑暗期后或連續(xù)光照條件下則會使開花顯著延遲［25］，與本試驗結(jié)論相反。推測可能是由于牽牛的開花由花前黑暗時間長短決定，當(dāng)黑暗期積累到一定時長后才會開花，而睡蓮和黃花菜的開花則受光照期長短調(diào)控。

除光周期外，溫度亦是植物生長發(fā)育的重要影響因子，且對開花有著巨大影響［26］。Balasubramanian 等人通過對擬南芥在不同溫度下開花情況的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)達到臨界閾值之后，即使微小的溫度變化也可以誘導(dǎo)植物的開花［27］。同時也有研究證明：環(huán)境溫度升高可促進擬南芥開花，而較低的溫度則會延遲開花［15］。在本研究中用黑白膜對整株‘大同黃花’進行晝/夜時長8/16 h 處理時，較其他2種遮光材料處理下開花時間表現(xiàn)出明顯提前，且其開口時間基本介于黑白膜處理下晝/夜時長12/12 h與10/14 h 之間，并表現(xiàn)出極度不穩(wěn)定性，這可能與黑白膜內(nèi)溫度升高有關(guān)。對黑白膜內(nèi)溫度進行測定，發(fā)現(xiàn)在8:00—10:00 時膜內(nèi)外溫差基本穩(wěn)定在4 ℃左右，而在12:00 時膜內(nèi)外溫差則升高到9 ℃。由此推測，在晝/夜時長為8/16 h 的黑白膜處理下，環(huán)境溫度的升高可能是導(dǎo)致‘大同黃花’開口時間不穩(wěn)定的重要原因。

在大多數(shù)物種中，開花伴隨著貯藏碳水化合物的轉(zhuǎn)化及糖類的運輸。許多植物的花瓣細胞中含有大量淀粉，在開放前不久，淀粉可迅速轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，從而調(diào)節(jié)滲透壓促使花瓣打開［28］。本研究中不同光周期條件下‘大同黃花’開花前碳水化合物含量均高于開花后，且碳水化合物含量始終保持為：蔗糖＞果糖＞淀粉。

CONSTANS (CO)是一種具有B-box 結(jié)構(gòu)域的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，CO 編碼的蛋白位于開花基因和生物鐘之間，是監(jiān)測光周期變化的必要元件，它通過感知光周期和生物鐘信號從而激活下游相關(guān)基因的表達，最終誘導(dǎo)植物開花［29］。不同物種CONSTANSlike 家族成員在光周期開花途徑中表達模式已被廣泛報道。劉芳等對小擬南芥ApCOL1 基因進行研究，發(fā)現(xiàn)其在SD 和LD 兩種光照條件下具有相似的晝夜表達特征［30］。石玉波分析了在不同光周期下百子蓮ApCOL 基因的表達節(jié)律，發(fā)現(xiàn)其均在黑暗期出現(xiàn)表達峰值，而在光照期下調(diào)表達［31］。本研究克隆得到HcCOL14 基因，該基因編碼的蛋白具有CO 家族基因典型的B-box 和CCT 結(jié)構(gòu)域。除晝/夜時長10/14 h 外，其它不同光周期下HcCOL14 基因在光暗交替時期均呈現(xiàn)出高表達，推測該基因可能在黃花菜花發(fā)育過程以及開花調(diào)控過程中發(fā)揮一定作用。

本研究通過對‘大同黃花’光周期響應(yīng)部位及不同光周期下黃花菜開口時間進行研究，為調(diào)控黃花菜開花節(jié)律奠定了基礎(chǔ)，對深入探討黃花菜開花機理、揭示植物開花機制多樣性具有重要意義。