王閩予，何民友，李國衛(wèi)，鄧淙友，孫冬梅

(1.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

茜草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名“茜根”，為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖，味苦，性寒，歸肝經(jīng)，具有涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)的功效，用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛[1]。茜草中主要含有蒽醌及其苷類、萘醌及其苷類、環(huán)己肽類、多糖類、萜類等成分[2-4]，具有抗腫瘤、升高白細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、抗風(fēng)濕、抗氧化、止血、抑菌等作用[5-7]。茜草主產(chǎn)于安徽、江蘇、山東、河南、陜西等地，以陜西、河南出產(chǎn)者量大且質(zhì)優(yōu)[8-10]。

2015年版《中國藥典》中以大葉茜草素、羥基茜草素作為評價茜草藥材質(zhì)量的指標(biāo)。中藥材來源廣泛，成分復(fù)雜，以單個或幾個目標(biāo)成分的檢測和控制難以反應(yīng)藥材的質(zhì)量[11]。中藥指紋圖譜技術(shù)可以整體、宏觀地表征被測樣品主要化學(xué)成分的特征，是目前公認(rèn)的最適合中藥物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一，用于中藥質(zhì)量的整體評價[12-15]。本研究建立茜草藥材的UPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析和相似度評價對不同產(chǎn)地的茜草藥材進(jìn)行評價，為全面評價茜草藥材質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters CORTECS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；ME204E型萬分之一天平(10 mg～220 g，d=0.1 mg)、XP26型百萬分之一天平(量程22 g，d=0.001 mg)(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(美國默克股份有限公司)。

羥基茜草素對照品(批號：111898-201603；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.5%)、大葉茜草素對照品(批號：110884-201606；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.5%)、茜草對照藥材(批號：121049-201705)均由中國食品藥品檢定研究院提供；三乙胺、三氟乙酸、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

茜草樣品經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖，18批茜草藥材信息詳見表1，均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS UPLC T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為260 nm；以甲醇為流動相A，以含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸的溶液為流動相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min。

表1 18批茜草藥材信息表Table 1 Information of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution

2.2 對照品溶液的制備

取羥基茜草素、大葉茜草素對照品適量，加甲醇制成羥基茜草素質(zhì)量濃度為36.33 μg/mL、大葉茜草素質(zhì)量濃度為31.98 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 對照藥材溶液的制備

取茜草對照藥材0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl溶液(體積比4∶1，下同)100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇-25%HCl溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對照藥材溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取茜草粉末(過二號篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25% HCl溶液(4∶1)100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，用甲醇-25% HCl溶液(4∶1)補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以羥基茜草素峰為參照峰(S峰)，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.05%～0.33%、0.56%～1.49%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以羥基茜草素峰為參照峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.05%～0.45%、0.41%～1.41%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茜草藥材(批號S4)粉末平行6份，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。以羥基茜草素峰為參照峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值分別為0.09%～0.33%、0.98%～2.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 茜草藥材指紋圖譜的建立 取18批茜草藥材，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，取上述18批供試品溶液及茜草對照藥材溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。茜草藥材對照指紋圖譜見圖1，茜草對照藥材指紋圖譜見圖2，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》對18批茜草藥材指紋圖譜進(jìn)行共有峰標(biāo)識，結(jié)果見圖3。

121620242832364044048t/minR(9)200150100500240U/mV7896(S)54321

121620242832364044048t/min20016012080400U/mV123456(S)789

10009008007006005004003002001000U/mVS18S17S16S15S14S13S12S11S10S9S8S7S6S5S4S3S2S1121620242832364044048t/min1234576(S)98

2.6.2 共有峰的確定 對18批茜草藥材指紋圖譜進(jìn)行分析，共有9個特征峰，經(jīng)與對照藥材參照物色譜進(jìn)行比對，指認(rèn)了其中的5個特征峰，分別是3號峰山柰素、5號峰茜草素、6號峰羥基茜草素、7號峰1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、8號峰大葉茜草素，羥基茜草素的峰面積較大、分離度較好，故以其為參照峰(S峰)，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間與相對峰面積，并計(jì)算RSD值，結(jié)果見表3、表4?？梢?，以羥基茜草素峰為參照峰，18批茜草藥材指紋圖譜的其余8個特征峰相對保留時間RSD值在0.25%～1.50%，均小于3.0%；18批茜草藥材指紋圖譜的9個特征峰相對峰面積的RSD在19.07%～70.84%，結(jié)果表明不同產(chǎn)地茜草藥材的各特征峰峰面積存在一定差異。

2.6.3 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012年版)，以茜草對照藥材指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評價，除S4相似度較低為0.637之外，其余17批不同產(chǎn)地茜草藥材的相似度為0.871～0.983，見表5。

表3 18批茜草藥材指紋圖譜相對保留時間測定結(jié)果Table 3 Relative retention time of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表4 18批茜草藥材指紋圖譜相對峰面積測定結(jié)果Table 4 Relative peak area of 18 batches of Rubia cordifolia L.

表5 18批茜草藥材 UPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

2.7 聚類分析 將18批茜草藥材指紋圖譜的9個共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SPSS20.0軟件，采用Eu-clidean距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4，當(dāng)類間距離為25時，18批茜草藥材可分為2類，S6～S7、S9～S11、S17～S18為一類，包含6批河南省和1批山東省樣品，S1～S5、S8、S12～S16為一類，包含5批河北省、2批河南省及陜西省、山西省、山東省各1批樣品。

910761117185151213141681234S9S10S7S6S11S17S18S5S15S12S13S14S16S8S1S2S3S4Y0510152025

2.8 大葉茜草素、羥基茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

2.8.1 線性關(guān)系考察 取羥基茜草素和大葉茜草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含羥基茜草素204.0 μg、大葉茜草素170.1 μg的混合對照品儲備液。精密量取上述混合儲備液0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得對照品線性溶液。精密吸取對照品線性溶液和混合對照品儲備液各2 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測量，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：羥基茜草素，y=48 068.341 3x-25 699.997 6，r=0.999 7，線性范圍2.040～204.0 μg/mL；大葉茜草素，y=28 091.977 5x-7 320.780 9，r=0.999 6，線性范圍1.702～170.1 μg/mL。

2.8.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為0.07%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取茜草藥材(批號S4)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為0.38%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茜草藥材(批號S4)約0.5 g，精密稱定，平行稱定6份，按“2.4”項(xiàng)下確定的供試品溶液制備方法，制備供試品溶液6份。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算羥基茜草素、大葉茜草素峰面積的RSD值分別為1.68%、1.24%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批茜草藥材(批號S4，大葉茜草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.40 mg/g，羥基茜草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.62 mg/g)，約0.25 g，精密稱定，分為3組，每組平行稱定3份，分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入對照品，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液9份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算羥基茜草素、大葉茜草素的平均加樣回收率分別為103.5%、98.8%，RSD值分別為2.67%、2.60%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.8.6 樣品測定 取18批茜草藥材，按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，18批茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果見表6。可見，18批茜草藥材的大葉茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.47%～1.18%，羥基茜草素的為0.36%～0.9%，其中S6、S7、S9、S10、S11的大葉茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為1.18%、1.06%、0.94%、0.81%和0.81%，S17、S18的羥基茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為0.90%和0.81%，表明河南省產(chǎn)的茜草藥材質(zhì)量較優(yōu)。

表6 18批茜草藥材中2種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

3 討論

本研究對檢測波長、色譜條件、供試品制備等進(jìn)行了考察，經(jīng)紫外-可見全波長(190～400 nm)掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm處各色譜峰較響應(yīng)值較均勻，各色譜峰信號較強(qiáng)，基線平穩(wěn)，干擾較小，因此選擇260 nm作為檢測波長；同時對甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、乙腈-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.3%甲酸、甲醇-0.2%三乙胺和甲醇-0.2%三氟乙酸等不同組成的流動相進(jìn)行了考察，結(jié)果以甲醇-含0.2%三乙胺和0.2%三氟乙酸溶液梯度洗脫樣品分離較佳。對CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)、YMC C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)4種品牌色譜柱的色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同品牌色譜柱對各特征峰分離影響較大，使用CORTECS T3(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)色譜柱各特征峰分離效果較好。在供試品溶液前處理中對比三乙胺用量、不同提取溶劑、提取方式及提取時間，發(fā)現(xiàn)使用甲醇-25%鹽酸(4∶1)混合溶液100 mL加熱回流60 min為最佳。

運(yùn)用相似度評價、聚類分析2種方法對不同產(chǎn)地茜草藥材UPLC指紋圖譜進(jìn)行分析。以茜草對照藥材指紋圖譜為對照，除S4相似度較低為0.637之外，其余17批不同產(chǎn)地茜草藥材的相似度為0.871～0.983，全部在0.8以上，說明不同產(chǎn)地藥材表現(xiàn)出了良好的相似度。聚類分析結(jié)果，除了2批河南省和1批山東省的藥材之外，可以將剩余河南省藥材與其他省份藥材區(qū)分開來，說明河南省所產(chǎn)茜草藥材質(zhì)量比較相近，其他省份茜草藥材質(zhì)量與之不同。含量測定結(jié)果顯示，河南省所產(chǎn)茜草藥材中大葉茜草素和羥基茜草素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，質(zhì)量較優(yōu)，與聚類分析的結(jié)果相吻合。

本研究建立了茜草藥材的UPLC指紋圖譜方法，共生成9個共有峰，較普通液相分析時間縮短了40 min，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，可較好的區(qū)分河南省與其他省份所產(chǎn)茜草藥材，為茜草藥材的綜合評價提供了參考。