楊宇婷，崔春雨

(河南師范大學(xué) 國(guó)家級(jí)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 新鄉(xiāng) 457003)

茜草有名茜根，俗名稱(chēng)拉拉藤、活血草、血見(jiàn)愁等[1]，為茜草科多年生植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根莖，在我國(guó)分布廣泛，南北各地均有分布，我國(guó)共有24種10變種，以西南地區(qū)為種類(lèi)最多，例如河南、山東、陜西、安徽、河北等地均大量出產(chǎn)，春秋兩季采挖，洗凈，干燥，切斷。茜草性寒味苦，歸肝經(jīng)。既能涼血止血，又能活血祛瘀。臨床上主要用其生品和茜草炭，茜草生品苦寒泄熱，涼血祛瘀，通經(jīng)，臨床用于吐血，衄血，崩漏，外傷出血，瘀阻經(jīng)閉，關(guān)節(jié)痹痛，跌撲腫痛[2]218-219。其炮制品炒炭后，味苦、澀，能增強(qiáng)止血作用[3]，臨床用于血痢，咯血，崩漏出血，尿血等各種出血?，F(xiàn)代化學(xué)研究茜草的化學(xué)成分多樣以蒽醌及其苷類(lèi)為主例如大葉茜草素、羥基茜草素、茜草素[3]等，此外還含有萘醌類(lèi)、萜類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖、微量元素等化學(xué)成分，對(duì)其化學(xué)成分和藥理作用再進(jìn)一步研究中。本文主要對(duì)茜草炮制前后化學(xué)成分的變化進(jìn)行研究，為臨床更好的使用茜草及炮制品提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

日本島津LC10A高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器SPD-M10AYP、四元低壓梯度泵、Class-VP 色譜工作站)、SG5200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)、FA2104B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)、100-2AS電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng))、752型紫外分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)。

大葉茜草素對(duì)照品(批號(hào)：110884-200604 中檢所)、沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：110831-201204 中檢所)碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、干酪素、水為分析純水、甲醇 四氫呋喃為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、茜草購(gòu)于河南省藥材公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 炮制方法

茜草生品：取茜草，除去雜質(zhì)，清水洗凈，潤(rùn)透后切成3 cm段，干燥。

茜草炭：取茜草段，置熱鍋內(nèi)，炒至表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色，噴淋少許清水，熄滅火星，取出，晾干[2]附錄ⅡD.。

2.2 炮制前后大葉茜草素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

按照2015年版《中國(guó)藥典》記載其色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：0.2%磷酸溶液(25∶50∶25)檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)過(guò)程中，結(jié)果并不理想，保留時(shí)間太長(zhǎng)，分離度不夠，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，磷酸溶液需要新鮮配制，易生微生物，操作繁瑣。因此，對(duì)色譜條件進(jìn)行重新篩選，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)結(jié)合查閱文獻(xiàn)[4-5]，色譜條件確定為：色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、流動(dòng)相：乙腈∶水(65∶35)、流速：1 mL/min、柱溫：30℃、檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm、進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

用甲醇精密配置各濃度大葉茜草素對(duì)照品溶液，濃度分別是：0.01、0.02、0.04、0.08、0.10 mg/mL。分別吸取10 μL進(jìn)樣，記錄相應(yīng)的峰面積。分析得：a=5 ×104 b+81637，r=0.9998，大葉茜草素進(jìn)樣量在0.01～0.10 mg之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其中a代表峰面積，b代表對(duì)照品濃度，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 大葉茜草素對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograph of mollugin

2.2.3 供試品溶液

取茜草生品及茜草炭適量粉碎，過(guò)60目篩。精密稱(chēng)取各樣品80 mg，放置于10 mL容量瓶中，加入8 mL甲醇，超聲波提取1 h，取出放冷、用甲醇定容至10 mL，提取液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.4 精密度考察

取0.04 mg/mL大葉茜草素對(duì)照品溶液，在2.2.1條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果大葉茜草素峰面積積分值的RSD為0.26%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 重現(xiàn)性考察

取茜草生品樣品5份，按2.2.3方法制備成供試溶液，在2.2.1條件下，進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果大葉茜草素峰面積的RSD為1.3%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察

取茜草生品室溫下放置，分別于0、2、4、6、8和10 h，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果大葉茜草素峰面積的RSD為0.5%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率考察

精密稱(chēng)取已知含量的茜草生品9份，每份40.0 mg，隨機(jī)分為3組，每組分別準(zhǔn)確加入大葉茜草素對(duì)照品，加入量分別為樣品中答應(yīng)我茜草素含量的80%，100%、120%。 按2.2.3方法制備成供試品溶液， 按2.2.1色譜條件下，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)得大葉茜草素的加樣回收率在97.90%，RSD為1.4%(n=9)。

2.2.8 樣品含量測(cè)定

取茜草生品及茜草炭樣品，按上述方法制備成供試溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，吸取供試品溶液10 μL進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定茜草生品中大葉茜草素的含量為0.53%，茜草炭中大葉茜草素的含量為0.35%。色譜圖見(jiàn)圖2、3。

圖2 茜草生品中大葉茜草素的含量Fig.2 Chromatograph of obtained from Rubia cordifolia L

圖3 茜草炭中大葉茜草素的含量Fig.3 Chromatograph of obtained from Rubia cordifolia L carbon

2.3 炮制前后鞣質(zhì)含量測(cè)定[2]附錄ⅩB

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按照2015年版《中國(guó)藥典》方法建立準(zhǔn)曲線(xiàn)：以吸光度a為縱坐標(biāo)，濃度b為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。a=4.015b-0.0582，r=0.9982。

2.3.2 供試品溶液的制備

取茜草生品及茜草炭粉末，精密2 g，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，超聲處理1 h放冷，用水定容至250 mL，搖勻，靜置，濾過(guò)，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 樣品測(cè)定

精密量取各種供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中。按照2010年版《中國(guó)藥典》方法測(cè)定各供試品中總酚量及不被吸附的多酚量，計(jì)算各供試品中鞣質(zhì)的含量：茜草生品中鞣質(zhì)的含量為：0.16%、茜草炭中鞣質(zhì)的含量為：0.33%。

3 結(jié)論

茜草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，2015年版《中國(guó)藥典》收錄其根、根莖。茜草根及根莖長(zhǎng)期以來(lái)作為天然染料和止血藥使用，其藥理活性和活血成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析。本文采用HPLC法及紫外-分光光度法測(cè)定茜草生品及茜草炭中大葉茜草素和鞣質(zhì)的含量。其中茜草炭中大葉茜草素的含量及茜草生品降低，鞣質(zhì)的含量明顯升高。制炭過(guò)程中溫度過(guò)高可能會(huì)造成大葉茜草素升華、分解造成含量降低，同時(shí)高溫造成其他化學(xué)成分分解為鞣質(zhì)，茜草炭中鞣質(zhì)的含量明顯增高。有實(shí)驗(yàn)表明鞣質(zhì)與止血作用[6]有一定的聯(lián)系，這也與茜草炭的藥活性相一致。在試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意溫度的控制，做到“炒炭存性”，避免炭化。