賴莎，陳麗麗，葉嘉俊，黃會平，易潤青，潘蕓蕓

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080； 2.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣東 廣州 510000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是最常見的疾病之一，由AS病變引起的腦卒中和冠心病已經(jīng)成為全世界引起死亡的重要原因，找到更好的治療方法是目前的迫切需要[1]。血管緊張素(1-7)[angiotensin(1-7)，Ang(1-7)]是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的新成員，主要由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2(ACE 2)分解血管緊張素II(Ang II)生成的一種具有生物活性的肽[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，Ang(1-7)可能通過改善血管內(nèi)皮功能、抑制平滑肌細胞增殖及遷移、降低血脂水平、減輕炎癥反應(yīng)，在AS發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要的保護作用[4]。因此，本研究從抑制血管內(nèi)皮細胞損傷和凋亡、炎癥反應(yīng)等方面，驗證Ang(1-7)對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的保護作用，為研究藥物經(jīng)Ang(1-7)調(diào)節(jié)途徑抗AS的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)(Life Technologies,InvitrogenTM)。

1.2 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司);胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；Ang(1-7)(美國Sigma公司)；Ang(1-7)抑制劑(A779，美國Sigma公司)；MTT細胞增殖檢測試劑盒(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；人血管生成素(Ang)、人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(NOS3/eNOS)、人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、人白介素1β(IL-1β)人白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Elabscience)；NO測試盒(南京建成)。

1.3 主要儀器

臺式低溫高速離心機(Z323K)(德國HERMLE公司，TGL-16G)；水平離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-80-2B)；普通培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，XMTD203)；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市晨陽電子儀器廠，XMTD203)；Thermo酶標儀(美國Thermo公司，MULTISKAN MK3)；FACScan流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司，AMG0002073)。

1.4 方法

1.4.1 HUVECs 培養(yǎng)與處理 HUVECs用含10%(φ) FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，在37 ℃、6%(φ) CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵化。倒置顯微鏡下觀察，待培養(yǎng)瓶中細胞生長至覆蓋瓶底90%以上時，進行傳代，收集原代培養(yǎng)3代以內(nèi)的HUVEGs，采用適當(dāng)方法儲存。

1.4.2 細胞接種 按照1×106個/mL 的密度，在六孔板上加入HUVECs細胞懸浮液，每個孔中補充完全培養(yǎng)液至2 mL，輕輕晃動六孔板混勻細胞懸液，并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達90%以上時，即可加藥干預(yù)并分組。

1.4.3 實驗分組 細胞分為：對照組(HUVECs+PBS)、模型組(HUVECs+100 μg/mL ox-LDL)、Ang(1-7)組[HUVECs+100 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L Ang(1-7)]、A779組(HUVECs+100 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L A779)。

1.4.4 細胞存活率的檢測 各組細胞懸液移植到96孔板，每孔0.09 mL，加入0.02 mL MTT試劑(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸出各孔液體加入0.2 mL DMSO，搖床震蕩10 min，于490 nm 波長處讀取其吸光度(A)。根據(jù)公式：細胞存活率=(實驗組A490-空白組A490)/(對照組A490-空白組A490)×100%，計算各組細胞存活率。

1.4.5 細胞凋亡的檢測 各組細胞懸液移植到六孔板，于室溫下避光加入Annexin V-FITC，染色10 min，同樣避光條件下再加入PI染色5 min，雙染色后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.6 血管內(nèi)皮因子、炎癥因子水平的檢測 加待測樣品0.1 mL于反應(yīng)孔中，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度(A)值，檢測各組Ang(1-7)、eNOS、NO、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs的細胞存活率

與對照組細胞存活率(99.98±4.27)%比較，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs模型組細胞存活率(38.75±2.34)%明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Ang(1-7)組細胞存活率(68.36±3.30)%顯著升高；而與Ang(1-7)組相比，A779組細胞存活率(40.62±2.63)%顯著下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

150100500細胞存活率/%對照組模型組Ang(1-7)組A779組***#

2.2 各組細胞凋亡率

與對照組細胞凋亡率(8.10±3.27)%比較，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs模型組細胞凋亡率(33.20±3.32)%明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Ang(1-7)組細胞平均凋亡率(24.10±3.97)%顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與Ang(1-7)組相比，A779組細胞平均凋亡率(40.60±4.18)%顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

***#細胞凋亡率/%50403020100對照組模型組Ang(1-7)組A779組

2.3 各組Ang(1-7)、血管內(nèi)皮因子NO、eNOS水平

如表1所示，與對照組比較，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs模型組Ang(1-7)、NO、eNOS水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Ang(1-7)組Ang(1-7)、NO、eNOS水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與Ang(1-7)組相比，A779組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 HUVECs的Ang(1-7)、NO、eNOS水平

2.4 各組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平

如表2所示，與對照組比較，ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Ang(1-7)組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與Ang(1-7)組相比，A779組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 HUVECs的TNF-α、IL-1β、IL-6水平

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：**P<0.05；與Ang(1-7)組比較：#P<0.05。

3 討論

AS作為一種常見疾病，可以在人體內(nèi)存儲多年，卻無任何病態(tài)顯現(xiàn)，然后會引起突發(fā)性局部組織缺血、心絞痛、心肌梗死、中風(fēng)或心力衰竭等癥狀[5-7]，嚴重影響人類的健康，已成為死亡的主要原因之一[1]。Ang(1-7)是由Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro組成的一種具有生物活性的肽[2-3]，在多種病理生理過程中拮抗Ang II，對于RAS系統(tǒng)過度激活所導(dǎo)致的病變起保護作用，如高血壓、心力衰竭和AS等[8-12]。

內(nèi)皮功能失調(diào)是AS發(fā)生的重要機制之一，包括NO合成明顯減少、內(nèi)皮源性血管舒張和收縮因子失衡。血管內(nèi)皮細胞不僅是Ang(1-7)的產(chǎn)生部位，還是其作用的主要靶點。研究發(fā)現(xiàn)，Ang(1-7)具有內(nèi)皮依賴性血管舒張活性，通過與VEC結(jié)合刺激NO、緩激肽或內(nèi)皮舒張因子產(chǎn)生[13-15]。本研究結(jié)果證實，在ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，Ang(1-7)可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮型eNOS活化，誘導(dǎo)NO釋放，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，保護動脈粥樣硬化損傷，并且這些作用能被Ang(1-7)的特異性拮抗劑(A779)全部阻斷。

自Ross[16]提出AS是一種慢性炎癥性疾病之后，炎癥在AS發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸得到公認。TNF-α、IL-1β、IL-6均是參與局部動脈斑塊和外周血循環(huán)的炎癥標志物，參與調(diào)控細胞的存活、增殖、死亡等多種功能[17-18]。本研究結(jié)果顯示，Ang(1-7)可拮抗ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，減少細胞凋亡，發(fā)揮了抑制炎癥的作用，而這種作用能被Ang(1-7)的特異性拮抗劑A779阻斷。

綜上所述，本研究采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型，分別用Ang(1-7)、A779進行干預(yù)，觀察過表達和阻斷Ang(1-7)后各組細胞存活和凋亡情況，Ang(1-7)的含量，NO、eNOS水平，以及相關(guān)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達。結(jié)果表明，Ang(1-7)可調(diào)節(jié)eNOS活化，誘導(dǎo)NO釋放，并減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放，明顯降低ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡和損傷的作用，具有抗AS的作用。