賴偉娜，歐彩詩，袁敏，何健，李坤平

(廣東藥科大學(xué) 1.藥學(xué)院； 2.中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006； 3.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東 廣州 510006； 4.湯臣倍健股份有限公司，廣東 廣州 511436)

蜂膠(propolis)是一種成分復(fù)雜的天然混合物，由蜜蜂從其蜂巢附近各種植物的莖、葉子、花及樹皮裂縫中收集得到的化合物和蜜蜂的唾液酶加工而成的高黏性物質(zhì)，富含酚酸類和黃酮類等成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝、降脂、抗感染等特性[1-3]。2015年版《中國藥典》記載蜂膠有補(bǔ)虛弱、化濁脂、止消渴之功效，主治體虛早衰、高脂血癥、消渴[4]。然而，剛采收的蜂膠粗品中含有較大量的蜂蠟、樹膠類成分，不宜直接使用，需經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶崛〖兓痆1-2]。傳統(tǒng)的蜂膠純化方法為溶劑萃取法，該方法簡單但有機(jī)溶劑消耗量大，環(huán)保性較差[5]。膜分離法和超臨界流體萃取法在蜂膠的加工中也有報道，但這些方法對設(shè)備要求高，工藝較復(fù)雜[5-6]。大孔樹脂吸附分離具有工藝簡單、易于再生等優(yōu)點，廣泛用于天然產(chǎn)物的提取純化。本研究旨在開發(fā)一種采用大孔樹脂富集純化蜂膠中活性成分的方法，對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)一步分析在大孔樹脂上的吸附行為，以期為后續(xù)工藝開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV752紫外-可見光分光光度儀(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

Folin-Ciocalteu 試劑(Sigma公司)；95%乙醇、無水乙醇、甲醇、Na2CO3、NaOH(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；沒食子酸對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%，批號A0110)和蘆丁對照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%，批號A0103H)為成都曼斯特科技公司產(chǎn)品。供試蜂膠樣品由湯臣倍健股份有限公司提供(批號：180701)。大孔樹脂：D101(陜西樂博生化科技有限公司)、LSA-21、LSA-40、LSA-900A、LX-32、LX-60、LX-98和XDA-8G(西安藍(lán)曉科技新材料有限公司)和FPA-98Cl(羅門哈斯公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮和總酚酸含量的測定

蜂膠總黃酮和總酚酸含量測定參考課題組前期研究[7]?？傸S酮測定以蘆丁為對照品，其工作曲線方程為A= 30.17 9C- 0.005 2(r=0.999)，在6.3～25.3 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好?？偡铀岷繙y定以沒食子酸為對照品，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測定，工作曲線方程為A= 90.583C+ 0.053 3(r=0.998)，在3.6～8.4 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 蜂膠提取液的制備

取-20 ℃預(yù)冷的蜂膠，快速粉碎，過篩，備用。取粉碎的蜂膠粉，用60%乙醇(用10% NaOH溶液調(diào)至pH 8-9)提取，料液比為1∶20，超聲(320 W、40 kHz)提取1 h，靜置，濾過，濾液即為待吸附液。

2.3 大孔樹脂富集純化蜂膠總黃酮及總酚酸的工藝研究

2.3.1 樹脂的篩選 準(zhǔn)確稱取9種預(yù)處理過的樹脂各1.000 g，分別加入“2.2”項待吸附液30 mL，室溫靜態(tài)吸附17 h后測定試液中總黃酮和總酚酸的濃度。根據(jù)吸附前后的濃度差，計算9種樹脂的總黃酮和總酚酸吸附量(表1)。再將吸附后的樹脂濾出，進(jìn)行解吸附實驗。其中，F(xiàn)PA98CL和LX98樹脂加入70%甲醇(用2 mol/L HCl調(diào)至pH=1)50 mL，其余7種大孔樹脂加入95%乙醇50 mL，室溫靜置解吸17 h，用“2.1”項方法檢測解吸附液中總黃酮和總酚酸的含量，計算解吸率(表1)。從表1結(jié)果可知，F(xiàn)PA-98Cl和LX98樹脂的靜態(tài)吸附量分別達(dá)到了80.72和97.54 mg/g(總黃酮)、91.53 和122.21 mg/g(總酚酸)，但是，F(xiàn)PA-98Cl樹脂的解析率達(dá)到了78.4%(總黃酮)和73.4%(總酚酸)，而LX98樹脂的解析率為56.6%(總黃酮)和49.7%(總酚酸)。綜合比較，選取FPA-98Cl樹脂進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同大孔吸附樹脂對蜂膠總黃酮和總酚酸的靜態(tài)吸附量和解吸率

2.3.2 FPA-98Cl樹脂最佳吸附濃度的確定 將“2.2”項的待吸附液(濃度為C0)進(jìn)行適當(dāng)稀釋，得到濃度為1/2C0和1/4C0的蜂膠供試液。再將FPA-98Cl樹脂3份(1.000 g)分別加至30 mL濃度為C0、1/2C0和1/4C0的蜂膠試液中，靜態(tài)吸附17 h后測吸附殘液中總黃酮和總酚酸濃度，計算吸附率結(jié)果見表2。可見，較低的初始濃度有利于吸附進(jìn)行，當(dāng)調(diào)節(jié)初始濃度為1/4 C0時，F(xiàn)PA-98Cl樹脂的吸附率達(dá)到了69.8%(總黃酮)和66.0%(總酚酸)，相當(dāng)于以料液比1∶80提取的蜂膠液。

表2 不同初始濃度對蜂膠總黃酮和總酚酸靜態(tài)吸附和解吸附的影響

2.3.3 FPA-98Cl樹脂解吸附條件 取吸附后的同一批FPA-98Cl樹脂9份，每份1.000 g，分別加入甲醇(pH值分別為1、2和3)30 mL、70%甲醇(pH值分別為1、2和3)30 mL和95%乙醇(pH值分別為1、2和3)30 mL，室溫，磁力攪拌解吸附3 h后測定總黃酮和總酚酸濃度，計算其解吸率，結(jié)果見圖1A、1B?？梢?，甲醇的解吸附效果好于70%甲醇和95%乙醇；且pH 值為3的甲醇，更適合于蜂膠黃酮和酚酸類成分在FPA-98Cl樹脂上吸附后的洗脫。

AB50403020100403020100總黃酮解吸率/%總酚酸解吸率/%甲醇70%甲醇95%乙醇甲醇70%甲醇95%乙醇123pH

2.4 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮及總酚酸的靜態(tài)吸附熱力學(xué)研究

2.4.1 實驗方法 參考常規(guī)的大孔樹脂吸附熱力學(xué)實驗方法[8-10]，精密稱取預(yù)處理過的FPA-98Cl樹脂2.000 g，分別加入50 mL總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、1.0、1.3、1.6、1.9 mg/mL，總酚酸質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、1.0、1.4、2.0、2.4 mg/mL的提取液，以120 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩吸附6 h后，測定吸附殘液中總黃酮和總酚酸濃度，并根據(jù)公式(1)計算樹脂的平衡吸附量(Qe)。

(1)

式中：Qe為樹脂對總黃酮/總酚酸的平衡吸附量，mg/g；C0為加入的提取液中總黃酮/總酚酸的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce為吸附平衡時的總黃酮/總酚酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；W為大孔樹脂的質(zhì)量，g。

2.4.2 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮和總酚酸的吸附等溫線及模型 從圖2 的FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮和總酚酸的吸附等溫線可見，在相同溫度下，F(xiàn)PA-98Cl樹脂吸附蜂膠總黃酮和總酚酸的平衡吸附量隨著蜂膠平衡濃度的增大而增大；在同一平衡濃度下，蜂膠總黃酮和總酚酸的平衡吸附量在溫度為40 ℃的情況下最大，30 ℃和50 ℃次之。

為明確蜂膠中總黃酮和總酚酸濃度與吸附量之間的關(guān)系，采用常用于描述溶液中溶質(zhì)吸附的Freundlich和Langmuir兩種模型對蜂膠總黃酮及總酚酸吸附等溫線進(jìn)行擬合，兩種模型方程見公式(2)和公式(3)[8-10]。

(2)

(3)

式中：KF為Freundlich模型的吸附常數(shù)；n為Freundlich模型的吸附指數(shù)；Qm為樹脂對蜂膠總黃酮/總酚酸的最大吸附量，mg/g；KL為Langmuir模型的平衡常數(shù)。

圖2 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮(A)和總酚酸(B)的吸附等溫線

將在不同溫度下蜂膠總黃酮及總酚酸的吸附等溫線數(shù)據(jù)依照上述模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表3和表4?？梢?，蜂膠黃酮和酚酸類成分在FPA98CL樹脂上的吸附行為，用這兩種模型擬合的效果都很好，R2值均大于0.95。但是，蜂膠總黃酮的吸附過程更符合Langmuir吸附等溫方程，而Freundlich吸附等溫方程則更適合用于描述蜂膠總酚酸的吸附。

表3 蜂膠總黃酮的Freundlich和Langmuir吸附等溫線模型參數(shù)Table 3 Freundlich and Langmuir adsorption isotherm model parameters of total flavonoids in Propolis.

表4 蜂膠總酚酸的Freundlich和Langmuir吸附等溫線模型參數(shù)

2.5 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮及總酚酸的靜態(tài)吸附動力學(xué)研究

2.5.1 實驗方法 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理FPA-98Cl樹脂3份(每份各3.000 g)加入90 mL蜂膠提取液，120 r/min恒溫振蕩吸附，定時取樣測定試液中總黃酮和總酚酸的濃度，直至吸附平衡。樹脂的吸附量(Qe)與時間(t)的關(guān)系如公式(4)[8-10]。

(4)

式中：Qe為t時刻測定的樹脂吸附量，mg/g；Ct為t時刻蜂膠總黃酮/總酚酸質(zhì)量濃度，mg/mL。

2.5.2 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮和總酚酸的靜態(tài)動力學(xué)曲線模型及參數(shù) 從圖3的FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮及總酚酸的靜態(tài)吸附曲線可見，隨著時間的延長，樹脂對蜂膠總黃酮及總酚酸的吸附量逐漸升高，在0～120 min時內(nèi)快速增加，在120～240 min范圍內(nèi)增長速度減慢，240 min后吸附趨于平緩，總黃酮最大吸附量為31.78 mg/g，總酚酸最大吸附量為13.13 mg/g。

為了考察蜂膠總黃酮及總酚酸在FPA-98Cl樹脂上的吸附動力學(xué)特征及其吸附機(jī)理，采用Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程、Mckay準(zhǔn)二級動力學(xué)方程和Weber-Morris顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程來描述和分析靜態(tài)吸附過程[8～10]，具體方程如公式(5)-公式(7)所示。

Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程：

ln (Qe-Qt) = lnQe-k1t

(5)

(6)

Weber-Morris顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程：Qt=k3t1/2+I

(7)

式中：Qt為t時刻的吸附量，mg/g；Qe為平衡吸附量，mg/g；k1為準(zhǔn)一級動力學(xué)模型的吸附平衡速率常數(shù)，min-1；k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的吸附平衡速率常數(shù)，g/(mg·min)；k3、I分別為顆粒內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)，mg/(g·min1/2)和常數(shù)。

圖3 FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮(A)和總酚酸(B )的靜態(tài)吸附曲線

將上述靜態(tài)吸附實驗結(jié)果分別采用上述3個動力學(xué)方程進(jìn)行擬合，得到各個模型的參數(shù)和相關(guān)系數(shù)見表5和表6?？梢?，蜂膠總黃酮在FPA-98Cl樹脂上的吸附動力學(xué)規(guī)律可采用Weber-Morris顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程描述，即(R2=0.950)；蜂膠總酚酸在FPA-98Cl樹脂上的吸附規(guī)律則更適合用Mckay準(zhǔn)二級動力學(xué)方程來描述，即Qt= 0.485 3t1/2+ 2.074 1(R2=0.965)。上述結(jié)果，與常見的總酚酸、總黃酮的大孔樹脂吸附熱力學(xué)和動力學(xué)研究報道一致[8-10]。

表5 蜂膠總黃酮樹脂吸附動力學(xué)模型擬合方程及模型參數(shù)Table 5 Adsorption kinetics equations and model parameters of flavonoids in propolis on FPA98CL resin

表6 蜂膠總酚酸樹脂吸附動力學(xué)模型擬合方程及模型參數(shù)Table 6 Adsorption kinetics equations and model parameters of phenolic acids in propolis on FPA98CL resin

3 討論

本研究通過靜態(tài)吸附和解吸試驗對9種大孔樹脂進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示FPA-98Cl樹脂對蜂膠黃酮和酚酸類物質(zhì)吸附量大，解吸率高，適合用于富集純化蜂膠中此類物質(zhì)。并且，當(dāng)上樣料液比為1∶80、洗脫液為pH=3的甲醇時，吸附解吸附效果最好。在對蜂膠中黃酮和酚酸類成成分在FPA-98Cl樹脂上的吸附熱力學(xué)進(jìn)一步研究時，發(fā)現(xiàn)Langmuir吸附等溫方程能很好地描述FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮的吸附行為；而對蜂膠總酚酸的吸附行為則更符合Freundlich吸附等溫線方程。在對蜂膠中黃酮和酚酸類成成分在FPA-98Cl樹脂上的吸附動力學(xué)進(jìn)一步研究時，發(fā)現(xiàn)Weber-Morris顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程能很好地描述FPA-98Cl樹脂對蜂膠總黃酮的吸附行為，而對蜂膠總酚酸的吸附行為則更符合Mckay準(zhǔn)二級動力學(xué)方程。

大孔樹脂吸附分離純化技術(shù)在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)應(yīng)用非常廣泛，但吸附樹脂的種類繁多，性能各異；對于不同的目標(biāo)組份，應(yīng)選擇適用的吸附樹脂[11-12]。對于蜂膠黃酮和酚酸類化合物而言，D101、AB-8、FL-1、LSA-21等樹脂均有相關(guān)的文獻(xiàn)報道[13-17]。在本研究中篩選到的FPA-98Cl樹脂為交聯(lián)丙烯酸陰離子交換樹脂，這與陳健等[18]選用FPA-98CL分離澤漆總黃酮的報道一致。然而，F(xiàn)PA-98Cl樹脂對酚酸類和黃酮類等含酚羥基化合物的吸著力較強(qiáng)，常需用酸性的強(qiáng)極性溶劑洗脫。從本文結(jié)果來看，洗脫溶劑種類及其pH值對洗脫效果影響較大。另外，由于結(jié)構(gòu)上的差異，黃酮酚酸類成分在FPA-98Cl樹脂上的吸附熱力學(xué)及動力學(xué)特征不一樣，說明蜂膠中不同成分在同一樹脂上的吸附行為存在較大的差異。