陳先兵，陳曦，韓紅敬，沈浣，趙永平

(北京大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100044)

圓頭精子癥1971年由Schirren等[1]首先報(bào)道，是畸形精子癥的一種亞型，是臨床上罕見(jiàn)并且嚴(yán)重導(dǎo)致男性不育的病癥，其特征是精子頭部呈圓形[1-2]，頂體畸形，嚴(yán)重者可出現(xiàn)頂體缺如。該類精子頂體結(jié)構(gòu)異常，其缺乏與卵細(xì)胞正常受精所必需的酶類，故無(wú)法穿過(guò)透明帶與卵細(xì)胞融合，因而圓頭精子癥患者臨床表現(xiàn)為男性不育。因此，圓頭精子癥患者只有借助卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)才有可能獲得子代[3-4]。雖然借助了ICSI技術(shù)，但圓頭精子ICSI受精率仍然非常低，臨床結(jié)局并不理想[5]。本文對(duì)3例圓頭精子癥患者接受ICSI助孕治療的臨床結(jié)局進(jìn)行分析，并對(duì)圓頭精子癥相關(guān)的病因機(jī)制進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，為臨床診療提供依據(jù)。

病例資料

選取2017年2月至2018年3月于北京大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心診斷并治療的3例因圓頭精子癥而不育的夫婦為研究對(duì)象。

一、診斷

3例患者性生活正常，體格檢查及男科?？茩z查未發(fā)現(xiàn)異常；無(wú)吸煙、酗酒、習(xí)慣用藥及藥物過(guò)敏史，無(wú)家族遺傳病。其配偶婦科檢測(cè)均正常，未發(fā)現(xiàn)可引起不孕的相關(guān)病史及體征。精液分析(WHO第五版[6])結(jié)果見(jiàn)表1。精子形態(tài)學(xué)分析(Diff Quik染色法)：精子畸形率100%，圓頭精子100%；精子形態(tài)學(xué)分析復(fù)查結(jié)果(改良巴氏染色法)：精子畸形率100%，圓頭精子100%；經(jīng)電子顯微鏡分析(TEM)確診為圓頭精子癥。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)(Sperm chromatin structure assay，SCSA)檢測(cè)精子DNA碎片率(Sperm DNA Fragmentation Index，SDFI)。

表1 患者基本資料

二、ART治療與結(jié)局

病例1與病例2夫婦施行ICSI結(jié)合人工輔助卵母細(xì)胞激活(AOA)治療(使用鈣離子載體A23187引起卵胞質(zhì)內(nèi)鈣離子振蕩來(lái)激活卵子)。病例3夫婦第1個(gè)周期施行ICSI治療，未實(shí)施AOA，第2個(gè)周期施行ICSI-AOA治療(表2)。

病例1和病例2患者夫婦均采用常規(guī)長(zhǎng)方案(達(dá)菲林/果納芬/艾澤)進(jìn)行降調(diào)節(jié)和促排卵。共獲卵25枚。其中MⅡ 卵子23枚，對(duì)MⅡ卵子行ICSI-AOA處理，2PN受精10枚，卵裂率100%，總體ICSI受精率為43.5%(10/23)。胚胎培養(yǎng)至第3天觀察，共獲得質(zhì)量好的胚胎5枚(7～10細(xì)胞，碎片≤15%，卵裂球大小大致均等)和1枚中等質(zhì)量的5細(xì)胞胚胎，胚胎利用率60%。2例患者配偶均接受新鮮周期單胚胎移植(D3胚胎)，共移植胚胎2枚，未懷孕。之后，接受凍融周期單胚胎移植3個(gè)周期(病例1，2個(gè)周期；病例2，1個(gè)周期)，均獲得臨床妊娠，總移植周期臨床妊娠率為40%(2/5移植周期)，累積臨床妊娠率為100%，2例患者配偶成功分娩，出生2名健康嬰兒。

病例3采用短效長(zhǎng)方案(達(dá)必佳/果納芬/HCG)進(jìn)行降調(diào)節(jié)和促排卵，共接受2次ICSI周期助孕治療，共獲得19枚卵子。第1個(gè)取卵周期獲取9枚卵子，MⅡ卵8枚，未實(shí)施AOA，8枚MⅡ卵子均未受精及卵裂；第2次取卵周期獲卵10枚，MⅡ卵10枚，使用ICSI-AOA處理，獲得1枚2PN受精卵和1枚1PN受精卵，ICSI受精率20%(2/10)。受精卵培養(yǎng)到第3天均停止發(fā)育。隨后對(duì)該患者行全外顯子基因篩查。報(bào)告提示該患者DPY19L2(c.1553_1554delAT)基因純合突變。經(jīng)遺傳咨詢后，患者行供精人工助孕。

表2 患者治療情況

討 論

圓頭精子癥是由于基因突變導(dǎo)致的一種臨床上罕見(jiàn)，但嚴(yán)重影響生育的先天性畸形精子癥，在男性不育患者中的發(fā)生率<0.1%。其特征是精子頂體發(fā)生異常[2，5]，主要表現(xiàn)為精子頭部呈圓形、頂體結(jié)構(gòu)異常或無(wú)頂體，可伴有精子頸中段或尾部形態(tài)異常。精子頂體內(nèi)含有頂體酶、透明質(zhì)酸酶等穿透卵細(xì)胞所必需的多種酶類，故頂體的缺如必將導(dǎo)致“穿卵”能力嚴(yán)重受損，精卵無(wú)法結(jié)合，因此圓頭精子癥患者主要臨床表現(xiàn)為不育，輔助生殖技術(shù)是其生育后代的首選途徑。

圓頭精子癥目前比較認(rèn)可的是根據(jù)嚴(yán)重程度將其分為兩種類型：Ⅰ型(完全型)，完全沒(méi)有頂體及頂體酶；Ⅱ型(部分型)，保留部分頂體或存在其他類型的精子形態(tài)異常[7]。圓頭精子在精子形態(tài)學(xué)分析中，一般表現(xiàn)為精子頭呈圓形或球形，頂體缺失、無(wú)頂體后致密帶。在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)以精子頭部前1/3淡染為主的超大圓頭精子、以精子頭深染為主的較小的圓頭精子以及多種多樣特征的圓頭精子。在電鏡下觀察可見(jiàn)精子呈較大圓頭，無(wú)頂體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核內(nèi)有空泡，線粒體空泡化，微管結(jié)構(gòu)不明顯，排列紊亂。有報(bào)道顯示，可能由于高爾基體來(lái)源的囊泡與核膜錯(cuò)位，及核被膜特定成分的缺乏，導(dǎo)致頂體發(fā)生過(guò)程出現(xiàn)障礙，進(jìn)而出現(xiàn)圓頭精子[8]。

圓頭精子癥更深層的發(fā)生機(jī)制目前尚未明確，但進(jìn)一步的遺傳譜系分析揭示了可能的常染色體隱性遺傳的遺傳基礎(chǔ)，是該病癥發(fā)病的原因之一[9-10]。在針對(duì)圓頭精子癥發(fā)生機(jī)制的分析中，所涉及到的基因主要與高爾基體組裝、精子頂體形成、頭部成形以及與透明帶結(jié)合有關(guān)。研究人員通過(guò)不同的的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)圓頭精子癥的遺傳基礎(chǔ)。具體如下：一是專門設(shè)計(jì)各種基因敲除小鼠模型來(lái)研究圓頭精子的形成機(jī)制，目前涉及的基因主要有：HIV-1轉(zhuǎn)動(dòng)結(jié)合蛋白(HIV-1 Rev binding protein，Hrb)基因[11]、透明帶結(jié)合蛋白(ZP binding protein 1，Zpbp1)基因[12]、熱休克蛋白(Heat shock protein 90b1，Hsp90b1)基因[13]、 囊泡分選相關(guān)蛋白(vacuolar protein sorting-associated protein 54，Vps54)基因[14]、精子頂體膜相關(guān)蛋白(sperm acrosomal membrane-associated protein 32，SAMP32)基因[15]、酪蛋白激酶Ⅱα(Casein kinase Ⅱα’ prime polypeptide，Csnk2α2)基因[16]、高爾基體相關(guān)的包含有PDZ和卷曲盤旋的蛋白(Golgi-associated PDZ and coiled-coil motif containing protein，GOPC)基因[17]、β葡糖苷酶(β-Glucosidase 2，Gba2)基因[18]、人類蛋白激酶C1(Protein interacting with C kinase 1，PICK1)基因[19]等。二是尋找并確定那些與“頂體形成”有關(guān)的蛋白，目前已知的如睪丸生精相關(guān)蛋白 (sperm-associated antigen 4-like protein，SPGL4)[20]、Calicin蛋白[21]等。三是對(duì)圓頭精子癥患者的基因組和與該綜合征相關(guān)的基因進(jìn)行全基因組掃描分析，涉及到的基因主要有：精子發(fā)生相關(guān)(Spermatogenesis-associated 16，SPATA16)基因和DPY19L2(DPY-19-like2)基因[10，22]等。目前為止，在圓頭精子癥患者中檢測(cè)到的基因主要有DPY19L2、SPATA16、PICK1和Calicin[10，21-23]。這些研究提示今后仍應(yīng)注重那些參與并影響頂體形成過(guò)程的關(guān)鍵蛋白、高爾基體組裝、頂體結(jié)構(gòu)蛋白等形成、輸送與裝配相關(guān)的基因，以及這些基因與圓頭精子形成的相關(guān)性的研究，因?yàn)檫@些相關(guān)基因任何的異常均可能會(huì)導(dǎo)致頂體缺失，進(jìn)而導(dǎo)致圓頭精子形成。

研究表明，DPY19L2是在圓頭精子癥患者中最常見(jiàn)的突變基因[24]，DPY19L2基因的純合缺失決定著大多數(shù)的Ⅰ型圓頭精子癥[25]。Koscinski等[26]最先指出第12號(hào)染色體上的DPY19L2基因純合缺失是該家系患者發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，其中DPY19基因家族包含4個(gè)基因：DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3和DPY19L4。DPY19L2起源于DPY19L1，由7號(hào)染色體上的DPY19L1復(fù)制以后，再重新定位于12號(hào)染色體而形成DPY19L2。DPY19L2基因包含22個(gè)外顯子，編碼具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，因此推測(cè)其編碼蛋白作用于細(xì)胞膜上。國(guó)外研究利用DPY19L2敲除大鼠的動(dòng)物模型，證實(shí)DPY19L2基因缺失會(huì)引起核致密層以及頂體錨定體盤(acroplaxome)與核膜結(jié)合處的連接不穩(wěn)定，使得精子頂體及尾管不能與細(xì)胞核相連，進(jìn)而導(dǎo)致囊泡運(yùn)輸中斷，精子核無(wú)法成型，未結(jié)合的頂體囊泡消失，最終精子頂體不能形成[22]。本組病例3為DPY19L2(c.1553_1554delAT)基因純合突變，100%圓頭精子癥，也從側(cè)面印證了這個(gè)論斷，為圓頭精子癥的分子遺傳基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。病例1、2由于不同意實(shí)施全外顯子基因檢測(cè)，無(wú)法得知是否存在圓頭精子癥相關(guān)基因突變。

圓頭精子癥目前尚無(wú)有效的治療方法，ICSI通常是其首選方法，但大都表現(xiàn)為受精失敗或受精率極低，可能是與卵母細(xì)胞激活缺陷有關(guān)[5，27]。目前AOA最常用的是使用鈣離子載體引起卵胞質(zhì)內(nèi)鈣離子振蕩來(lái)激活卵子，ICSI聯(lián)合AOA可以提高圓頭精子癥患者的受精率并獲得臨床妊娠[3，28]。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)位于精子核周鞘上的特殊磷脂酶C(PLCzeta)具有激活卵母細(xì)胞的作用，在精子-卵子融合后進(jìn)入卵母細(xì)胞，并通過(guò)觸發(fā)一系列Ca2+振蕩來(lái)激活哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞，為PLCzeta作為卵母細(xì)胞激活因子提供了證據(jù)[29]。國(guó)外的一些研究甚至建議PLCzeta可用作男性受精和妊娠成功的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，特別是對(duì)圓頭精子癥患者更為適用[30]。近來(lái)的研究也表明由DPY19L2缺失導(dǎo)致的圓頭精子癥不育夫婦中，表現(xiàn)出了精子PLCzeta的低表達(dá)，也證實(shí)了AOA的應(yīng)用提高了ICSI的受精率并帶來(lái)可接受的活產(chǎn)率[31]。對(duì)于本研究中的這3例患者，本中心均建議ICSI-AOA方案，前2例患者同意此方案，病例3一開(kāi)始拒絕使用ICSI-AOA方案，ICSI治療失敗后才采用ICSI-AOA方案。從整個(gè)結(jié)果來(lái)看，前兩例患者總體受精率為43.5%，妊娠率為40%，受精率明顯高于病例3。

SDFI被認(rèn)為是一個(gè)新的評(píng)價(jià)精子質(zhì)量和預(yù)測(cè)生育能力的指標(biāo)[32]。圓頭精子癥患者的精子通常顯示出高水平的染色質(zhì)不成熟、泛素化和表觀遺傳異常，這可能導(dǎo)致更高的精子DNA碎片率[33-34]。病例3 檢測(cè)SDFI為48.6%，即使使用了ICSI-AOA療法，但結(jié)局仍不理想，這可能是其原因之一。

盡管本中心使用ICSI聯(lián)合AOA讓圓頭精子癥患者的配偶獲得了臨床妊娠，但AOA誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞激活機(jī)制與卵母細(xì)胞生理性激活機(jī)制是否完全一致，AOA方案是否對(duì)胚胎有更進(jìn)一步的影響，仍需更多的臨床研究來(lái)證實(shí)。對(duì)于100%圓頭精子癥患者，ICSI-AOA是其可行的方案，但此方案的安全性，以及對(duì)圓頭精子癥患者實(shí)施ICSI治療是否對(duì)妊娠結(jié)果產(chǎn)生影響，依然值得深入研究。