馮曉琴，曹瑩麗，郭堯，徐瑞琴，王治平，李經(jīng)緯

(山西省人民醫(yī)院1.生殖醫(yī)學中心；2.婦產(chǎn)科；3.科教處，太原 030012)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RPL)是指2次及2次以上連續(xù)性發(fā)生在24周內(nèi)的胎兒丟失的妊娠現(xiàn)象[1-2]。流行病學調(diào)查研究顯示，越來越多的育齡女性遭受RPL的困擾，并且在近年來這一現(xiàn)象呈現(xiàn)上升趨勢[3]。RPL再發(fā)風險隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升，連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)臨床應(yīng)予以重點評估，既往RPL是導(dǎo)致女性后續(xù)妊娠失敗的獨立危險因素，曾有3次及以上的RPL患者再次妊娠的流產(chǎn)風險接近40%[4]。因此，發(fā)掘復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的具體病因顯得尤為迫切和重要。然而，導(dǎo)致RPL的原因有很多，其中包括遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、免疫因素和男方因素等[5]。免疫因素導(dǎo)致的RPL的分子機制目前仍不清楚，但大部分趨向免疫耐受的平衡研究[6]。妊娠這一生理過程屬于半同種異體移植，從胚胎的成功種植到最后分娩整個過程需要復(fù)雜的免疫機制調(diào)控[7]。人類白細胞抗原-G(HLA-G)是一類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，HLA-G參與調(diào)控移植排斥反應(yīng)和逃避免疫應(yīng)答，可能還參與母胎界面的免疫耐受[8]。干擾素γ(IFN-γ)是一種由T1淋巴細胞(Th1)分泌的多效性因子，在參與抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用，在妊娠早期階段對血管重塑也有積極作用[9-10]?；谀壳癏LA-G和IFN-γ與RPL的相關(guān)性仍不清楚，雖然目前動物水平的實驗研究較多，但并沒有關(guān)于這兩個因子在RPL患者與正常妊娠者之間差異比較的分析報道。本研究通過臨床采集RPL患者和正常妊娠者的外周血和流產(chǎn)絨毛樣本，多角度比較RPL患者和正常妊娠者外周血以及流產(chǎn)絨毛組織中HLA-G和IFN-γ的表達差異，探討HLA-G和IFN-γ與RPL的相關(guān)性，為臨床診治RPL提供新的理論依據(jù)和診療思路。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年4月至2019年7月至我院生殖醫(yī)學中心和婦產(chǎn)科門診診治的70例流產(chǎn)患者為研究對象，根據(jù)流產(chǎn)發(fā)生的起因分組，分為RPL不孕癥患者的RPL組(n=29)和正常終止妊娠的早孕女性的對照組(n=41)。

RPL組患者納入標準：臨床確診為稽留流產(chǎn)的患者，超聲證實為宮內(nèi)孕，未見胚芽或有胚芽但未見心管搏動，流產(chǎn)次數(shù)2～3次者，夫婦雙方染色體核型正常。排除標準：有家族遺傳病史、遺傳性易栓癥(PTS)、抗磷脂綜合征(APS)、內(nèi)分泌疾病因素、解剖學畸形因素、宮內(nèi)感染因素、男方不育因素以及環(huán)境因素(吸煙酗酒、藥物使用史等)等導(dǎo)致的不孕。

對照組患者納入標準：超聲顯示證實為宮內(nèi)早孕，有胚芽及或原始心管搏動，既往無自然流產(chǎn)、死胎、畸胎等不良孕產(chǎn)史或有既往正常分娩健康嬰兒史，既往無妊娠期高血壓疾病、糖尿病及全身急、慢性疾病。排除標準：有家族遺傳病史、夫婦雙方或一方染色體核型異常、基礎(chǔ)婦科和內(nèi)分泌疾病因素、解剖學畸形因素、不良環(huán)境暴露因素。

二、試劑和儀器

1.主要試劑：Trizol(15596-026，Invitrogen，美國)、氯仿(南京化學試劑有限公司)、異丙醇(南京化學試劑有限公司)、0.1% 焦碳酸二乙酯(DEPC)水(KGDN4500，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)、紅細胞裂解液(R7757，Merck，德國)、cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036B，TaKaRa，日本)、實時定量PCR試劑盒(One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit II，RR086B，TaKaRa，日本)、酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢默沙克生物)。

2.主要儀器：紫外光度儀(UV-2450，SHIMADZU，日本)、PCR儀(veriti 96 well thermal cycler，ABI，美國)、熒光定量PCR循環(huán)儀(step one plus real time-PCR system，ABI，美國)。

三、研究方法

1.酶聯(lián)免疫法檢測：抽取受試者空腹時的外周血5 ml于真空采血管中，靜置30 min，297g低速離心10 min，提取上清，于-80℃低溫保存待測。按照試劑盒的操作說明步驟進行。

2.外周血白細胞和流產(chǎn)絨毛組織總RNA提取：外周血白細胞總RNA的提?。簩⒖鼓耐庵苎謩e加入到1.5 ml EP管中，每管400 μl，加入預(yù)冷的紅細胞裂解液，靜置10 min，4℃離心棄上清，重復(fù)一次。將離心后白細胞沉淀加入100 μl紅細胞裂解液，輕柔吹打均勻，然后將幾管合為一管，4℃離心棄上清。加1 ml預(yù)冷的Trizol于EP管中，按照Trizol試劑步驟提取。流產(chǎn)絨毛總RNA的提?。簩⒘鳟a(chǎn)絨毛組織剪碎放入勻漿器中，加入1 ml預(yù)冷的Trizol，反復(fù)研磨至大部分樣品溶于Trizol中，將樣品倒入1.5 ml離心管，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離，按照Trizol試劑提取進行。測定外周血和流產(chǎn)絨毛樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定濃度和純度，OD260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度可以用于后續(xù)試驗。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：上述提取的總RNA立即進行反轉(zhuǎn)錄或-70℃保存。cDNA第一鏈合成(20 μl體系)：總RNA(2 μg)2 μl，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，加無核酸酶的雙蒸水至總體積10 μl，132g離心20 s，先在37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，再置于冰上5 min。上述產(chǎn)物可立即進行下一步的PCR反應(yīng)或-20℃保存。HLA-G、IFN-γ和內(nèi)參GAPDH使用各自的引物(表1)進行擴增。擴增反應(yīng)體系：稀釋10倍的cDNA模板1 μl，2×Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，引物MIX(上游引物序列F/下游引物序列R各為10 μmol/L)2 μl，加0.1% DEPC水至總體積20 μl。擴增循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15～50 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共進行40個循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物序列

四、觀察指標：比較兩組患者的一般資料，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕周、基礎(chǔ)FSH、LH、E2、HCG和孕酮；兩組患者的血清HLA-G和IFN-γ水平；兩組患者外周血白細胞和流產(chǎn)絨毛中HLA-G和IFN-γ的mRNA相對表達水平。

五、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、兩組患者的一般資料比較

RPL患者的年齡范圍為22～41歲，平均年齡(34.61±6.24)歲，孕周在12周內(nèi)，平均孕周在(8.44±0.35)周；對照組患者的年齡范圍在22～38歲，平均年齡(32.83±6.14)歲，孕周在12周內(nèi)，平均孕周為(8.71±1.06)周；兩組患者的年齡、孕周、BMI、基礎(chǔ)FSH、LH和E2水平比較，均無顯著性差異(P>0.05)；RPL組患者在胎停7～8周時血清HCG和孕酮水平顯著低于對照組 (P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的一般資料比較(-±s)

二、兩組患者外周血中HLA-G和IFN-γ水平比較

酶聯(lián)免疫法檢測兩組患者血清HLA-G和IFN-γ水平，發(fā)現(xiàn)RPL組的HLA-G水平顯著低于對照組，而IFN-γ水平顯著高于對照組(P<0.05) (表3)。

表3 兩組患者血清中HLA-G和IFN-γ的水平比較(-±s)

qRT-PCR法進一步檢測兩組患者外周血白細胞中HLA-G和IFN-γ的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)RPL組HLA-GmRNA表達水平顯著低于對照組，而IFN-γmRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.01圖1 兩組患者外周血白細胞中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA的相對表達水平

三、兩組患者流產(chǎn)絨毛組織中HLA-G和IFN-γmRNA表達

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，RPL組流產(chǎn)絨毛組織中HLA-GmRNA的表達量顯著低于對照組，而IFN-γmRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.01)(圖2)。

與對照組比較，*P<0.01圖2 兩組患者流產(chǎn)絨毛組織中HLA-G mRNA和IFN-γ mRNA相對表達水平

討 論

IFN-γ是由Th1類淋巴細胞分泌的多效性因子，可促使毒性T淋巴細胞(CD8T)的增殖和分化，可識別病毒抗原感染的細胞以及腫瘤細胞，對其進行殺傷作用[11]。近年來的研究表明，IFN-γ可能參與妊娠早期的血管重塑和蛻膜完整性的調(diào)控[12]。但是，過量表達的IFN-γ將破壞妊娠早期母體的免疫耐受，導(dǎo)致胎盤形成受阻及早產(chǎn)等病理妊娠發(fā)生[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠小鼠體內(nèi)的IFN-γ對子宮內(nèi)膜血管的重塑有積極作用[14]。Yang等[15]的研究表明，正常孕鼠妊娠13～16 d時，IFN-γ高表達有利于子宮內(nèi)膜蛻膜化，創(chuàng)造有利于胚胎種植的內(nèi)膜環(huán)境。然而本研究發(fā)現(xiàn)，RPL患者血清IFN-γ水平反而是顯著高于正常妊娠者(P<0.05)，提示IFN-γ因子在妊娠初期對于胚胎植入過程的影響并不完全是積極作用。Li等[16-17]研究表明，妊娠雌鼠體內(nèi)IFN-γ過量表達將嚴重影響雌鼠子宮內(nèi)膜容受性從而調(diào)控免疫細胞和趨化因子的異常表達最終導(dǎo)致小鼠妊娠失敗。本研究在人體水平上進一步證實了RPL患者外周血和流產(chǎn)絨毛組織中IFN-γmRNA的相對表達量均顯著高于正常妊娠女性(P<0.05)，提示妊娠早期IFN-γ因子表達異常增高可能不利于胚胎的穩(wěn)定種植和妊娠維持，IFN-γ的異常波動與RPL的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。結(jié)合本研究中的RPL女性胚胎停育大多發(fā)生在孕40～60 d左右，由此我們推測，IFN-γ在正常妊娠初期的表達可能是一個曲線走勢，即懷孕開始階段IFN-γ高表達，促進母胎界面血管重塑，幫助胚胎侵襲子宮內(nèi)膜；隨著胚胎的不斷植入，在孕早期40～60 d時IFN-γ表達下調(diào)才能有效協(xié)助母體免疫自然殺傷細胞(NK)細胞蛻膜化，發(fā)揮保護胚胎的作用。本研究的RPL患者外周血和流產(chǎn)絨毛組織中IFN-γmRNA相對表達量均顯著高于正常妊娠者，表明在此孕期階段這些RPL患者體內(nèi)的IFN-γ表達未能有效下調(diào)，因此引起母胎免疫系統(tǒng)耐受紊亂，對胚胎產(chǎn)生排斥作用而引發(fā)流產(chǎn)。因此，在妊娠初期，IFN-γ因子的水平可能是一個動態(tài)變化的狀態(tài)，并且在孕初期的不同階段需要維持在一個適度的范圍內(nèi)，表達過低不利于胚胎侵襲和血管重塑，表達過高可能會逆轉(zhuǎn)母體免疫系統(tǒng)對胚胎的耐受作用，引發(fā)母體免疫系統(tǒng)對胎兒的排斥。妊娠早期RPL女性異常高表達的IFN-γ因子可能促使母體免疫調(diào)控向炎性方向發(fā)展，識別并排斥帶有一半父本抗原的胚胎，不利于胚胎著床和胎盤形成從而導(dǎo)致流產(chǎn)。

HLA-G屬MHC分子中的一類人類白細胞抗原-G亞型，最初是在器官移植的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，參與免疫耐受和腫瘤逃逸[18]。HLA包括Ⅰb型和Ⅰa型這兩類亞型，HLA-G屬于Ⅰb類亞型，可促進絨毛著床和血管發(fā)育，在母體妊娠初期適量表達，可能參與穩(wěn)定母胎免疫耐受。另一類亞型Ⅰa類包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，這幾類亞型屬于高度多態(tài)性MHC，主要激發(fā)對異體的排斥反應(yīng)，妊娠初期需要母體的Ⅰa類HLA沉默[19]。Morandi等[20]分析表明，與Ⅰa類MHC亞型相比，HLA-G具有低多態(tài)性和嚴格的組織特異性，發(fā)現(xiàn)其主要存在于在母胎界面絨毛滋養(yǎng)層細胞、女性生殖道、卵泡液以及體外培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)液中，可能參與胚胎著床的免疫耐受。

Tilburgs等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G和蛻膜自然殺傷細胞(dNK)之間存在短暫的微循環(huán)信號對話，參與調(diào)控母體dNK的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，為胚胎著床準備有利的內(nèi)膜環(huán)境。最新研究表明，母胎界面HLA-G是連接絨毛滋養(yǎng)層細胞與dNK的關(guān)鍵橋梁分子，絨毛滋養(yǎng)層HLA-G的穩(wěn)定表達能有效激活母體dNK特異性轉(zhuǎn)錄因子同源框(PBX1)的活化，從而誘導(dǎo)母體大量表達多效生長因子(PTN)和骨甘氨酸(OGN)，這些促生長因子的持續(xù)作用方可維持妊娠初期胎兒的穩(wěn)定發(fā)育[22-23]。這些研究從動物層面上闡述了在胚胎植入初期，HLA-G參與母胎免疫耐受的重要性，妊娠初期上游母胎界面HLA-G的穩(wěn)定表達，能有效保證下游生長因子的功能。李婷等[24]用酶聯(lián)免疫法研究顯示，RPL患者血清HLA-G水平低于無自然流產(chǎn)史的妊娠孕婦。本研究首先比較了兩組患者血清HLA-G水平，發(fā)現(xiàn)RPL組患者血清HLA-G水平顯著低于對照組(P<0.05)；然后進一步用qRT-PCR比較RPL患者和正常妊娠終止者外周血和流產(chǎn)絨毛組織中HLA-GmRNA的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPL組患者的外周血和流產(chǎn)絨毛中的HLA-GmRNA表達均顯著低于妊娠正常維持的女性(P<0.01)。這一研究結(jié)果表明，HLA-G參與妊娠早期胚胎穩(wěn)定的植入，低于妊娠維持正常水平的HLA-G與RPL的發(fā)生相關(guān)。妊娠初期，如果HLA-G表達下調(diào)，可能會影響胚胎侵入子宮蛻膜和重鑄螺旋動脈，絨毛著床不充分，嚴重影響胎盤的形成。但是，Hviid[25]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠初期如果HLA-G水平過高，滋養(yǎng)細胞侵蝕內(nèi)膜力度就會增強，可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細胞腫瘤發(fā)生。因此，妊娠早期HLA-G水平也需維持在一個合適的范圍之內(nèi)，水平過低不利于胚胎的穩(wěn)定植入和妊娠的維持，水平過高將逆轉(zhuǎn)它的積極效應(yīng)，對母體產(chǎn)生不利影響。

Yang等[15]的研究顯示，妊娠早期IFN-γ高表達會促進MHC的表達，MHC表達上調(diào)后作用于NK，一方面使NK細胞的免疫殺傷作用失活，另一方面又能促進NK細胞分泌保護性因子白介素-2(IL-2)和白介素-4(IL-4)，從而保持了母胎免疫耐受和妊娠維持?？梢?，妊娠初期MHC和IFN-γ的表達之間存在一定關(guān)聯(lián)。本研究中RPL患者的外周血和流產(chǎn)絨毛中IFN-γmRNA表達相較于正常妊娠者異常偏高，同時HLA-GmRNA表達量偏低。綜合分析，RPL患者同時存在IFN-γ和HLA-G表達水平的失衡，我們推測RPL患者妊娠初期IFN-γ異常偏高與MHC表達也可能存在一定的關(guān)聯(lián)，IFN-γ過表達可能下調(diào)HLA-G(Ⅰb類亞型MHC)表達，同時增強HLA-A、HLA-B和HLA-C(Ⅰa類亞型MHC)表達，HLA-G的下調(diào)和Ⅰa類亞型的上調(diào)活化母體輔助性T淋巴細胞(CD4T)反應(yīng)，母體免疫系統(tǒng)識別一半父本抗原的胚胎而產(chǎn)生排斥反應(yīng)。我們將后續(xù)擴大RPL組的樣本量進行驗證，深入研究IFN-γ過表達對HLA-G的調(diào)控以及對下游免疫因子的影響。

綜上所述，妊娠早期在維持母胎免疫耐受平衡的過程中，HLA-G和IFN-γ因子起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用，這兩類因子均需維持在一個合適的水平范圍內(nèi)。適量的IFN-γ和HLA-G因子有利于胚胎滋養(yǎng)細胞侵襲內(nèi)膜和妊娠的維持，在穩(wěn)定母體界面的免疫耐受方面起積極作用；HLA-G和IFN-γ的表達失衡不利于胚胎種植和妊娠穩(wěn)定，可能引起母體免疫系統(tǒng)對胎兒的識別和排斥反應(yīng)從而引發(fā)流產(chǎn)。本研究結(jié)果可能為臨床診療RPL患者提供有意義的理論依據(jù)和參考價值。