張巧利，王妍，賈嬋維，劉艷君，李芬

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，北京 100026；2.陜西省西安市第五醫(yī)院檢驗科，西安 710082；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061)

圍絕經(jīng)期是女性從育齡期進(jìn)入老年期必經(jīng)的人生階段，即女性從生殖功能旺盛的狀態(tài)逐漸過渡到生殖功能衰竭的階段。進(jìn)入圍絕經(jīng)期的婦女隨著卵巢排卵功能的減退，體內(nèi)雌、孕激素水平最終下降，月經(jīng)逐漸停止，可出現(xiàn)一系列軀體及精神心理癥狀。抑郁是一種精神障礙，患者社會功能下降，會產(chǎn)生極端的想法和行為。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示女性抑郁的發(fā)生率為25%，男性為12%[1]。圍絕經(jīng)期是婦女患抑郁癥最高的時期[2]，我們前期研究提示有絕經(jīng)相關(guān)癥狀的女性抑郁癥的發(fā)生率更高[3-4]。與絕經(jīng)前相比，圍絕經(jīng)期早期心理壓力增加[5]，抑郁的發(fā)生率是絕經(jīng)前的4倍[6]。據(jù)估計，到2030年，全世界將有12億婦女進(jìn)入更年期[7]，因此，對于圍絕經(jīng)期抑郁的研究顯得尤為必要和迫切。

腸道是人體最大、最主要的免疫器官，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與多種生理和精神疾病密切相關(guān)[8]，因此，腸道菌群與機體健康的相關(guān)研究已成為近年的焦點。腸道微生態(tài)可通過“微生物-腦-腸軸”作用于中樞系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與抑郁關(guān)系密切，補充腸道益生菌、調(diào)節(jié)腸道菌群可以改善抑郁狀態(tài)[9]。本研究以圍絕經(jīng)期抑郁大鼠為模型，研究其腸道菌群的變化，為圍絕經(jīng)期抑郁的治療提供實驗室依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物與設(shè)備

1.實驗動物：4月齡SD健康雌性未孕大鼠20只，體重(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供(批號：XAJT2013-056)。SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，室溫21℃～23℃，濕度50%～60%，晝夜明暗交替12 h：12 h，5只/籠。進(jìn)入實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，所有大鼠均常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。動物實驗獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.試劑：糞便基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)；DNA Marker和PCR試劑盒(大連寶生物工程)；蔗糖、戊巴比妥鈉(天津化學(xué)試劑三廠)；碘伏、丙烯酰胺(上海聯(lián)邁生物工程)；甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、瓊脂糖和溴化乙啶(上海欽誠生物科技)。

3.儀器：曠場實驗儀器(TSE Systems，德國)；C1000 TouchTM、Thermal Cycler PCR 儀、DCodeTM變性凝膠電泳儀和Gel DocTM2000 凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；InGenius3 Gel Documentation System凝膠成像儀(Syngene，英國)；強迫游泳實驗儀器(上海欣軟)。

二、研究方法

1.圍絕經(jīng)期大鼠造模：20只雌性SD大鼠均采用卵巢去勢形成圍絕經(jīng)期大鼠模型。所有大鼠用2%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉成功后，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。手術(shù)方法：大鼠取俯臥位，于背部中1/3處剪毛，用碘伏常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域的皮膚，自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約2～3 cm，切開皮膚，分別于左、右兩肋下剪開腰肌，暴露卵巢及緊密相連的子宮角，在子宮角上結(jié)扎兩側(cè)，并切斷，將卵巢摘出，縫合皮膚[10]。術(shù)后連續(xù)5 d皮下注射慶大霉素預(yù)防感染。第6天開始作陰道細(xì)胞學(xué)涂片，具體方法為：將無菌棉簽用無菌生理鹽水浸濕后插入大鼠陰道，充分沾取分泌物后取出，于清潔載玻片上涂片，用95%乙醇固定，在光學(xué)顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞角化指數(shù)(cornification index，CI)，1次/d，連續(xù)5 d，CI低于50%者為造模成功。

2.圍絕經(jīng)期抑郁大鼠造模：成功建立圍絕經(jīng)期大鼠模型后第12天，隨機選取10只大鼠為實驗組進(jìn)行抑郁造模，采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)[11]誘導(dǎo)大鼠抑郁。CUMS方案包括不同的應(yīng)激源，連續(xù)刺激28 d，每種應(yīng)激給予3次～4 次，連續(xù) 2 d 內(nèi)不能出現(xiàn)相同應(yīng)激。應(yīng)激刺激隨機排列如下：傾斜鼠籠 17 h；禁食、禁水20 h；濕籠 21 h；持續(xù)光照 17 h；電擊(30 V電壓)足底5 s；夾尾 1 min；行為限制2 h；4℃冰水游泳(水深以大鼠的后足尖能觸及桶底為準(zhǔn))5 min。造模結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)評估。

3.大鼠體重測量和行為學(xué)評估：(1)體重測量：通過應(yīng)激刺激前后體重變化評估大鼠負(fù)性行為。在CUMS實驗開始前測定大鼠基線體重，應(yīng)激刺激開始后每周固定時間記錄兩組大鼠體重。(2)糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)：待測大鼠禁水禁食12 h 后，單籠觀察1 h，鼠籠上放置1%的蔗糖水和普通飲用水各1瓶，自由飲用，分別稱量1 h前、后兩水瓶的重量，將兩次數(shù)值相減分別得出糖水飲用量和普通水飲用量。糖水偏愛率=糖水飲用量/(糖水飲用量+普通水飲用量)。(3)強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)：將大鼠放入直徑20 cm、高50 cm的圓柱形水缸，水深約40 cm，每次觀察 2 只。實驗開始后60 s為適應(yīng)時間，適應(yīng)結(jié)束后記錄5 min內(nèi)大鼠不動時間。(4)曠場實驗(open field test，OFT)：測試前先將待測大鼠放入100 cm×100 cm×50 cm的無蓋方箱(曠場)中30 min 以適應(yīng)環(huán)境，用Smart 3.0軟件將曠場劃為16個格子，中間4個格為中央?yún)^(qū)，其他12個格為周圍區(qū)。開始時將實驗大鼠頭部背對實驗者輕緩放入曠場實驗箱中央?yún)^(qū)，大鼠在曠場中先適應(yīng)30 s，然后進(jìn)行攝像記錄5 min內(nèi)的活動情況，統(tǒng)計大鼠在曠場的中央?yún)^(qū)運動總距離。每次測量前均用10%的酒精清洗實驗箱，以消除上一次大鼠留下的嗅覺刺激(如氣味、大小便等)。

4.大鼠糞便標(biāo)本的收集：圍絕經(jīng)期抑郁大鼠造模成功后處死兩組大鼠，無菌條件下取兩組大鼠結(jié)腸內(nèi)的糞便，置于無菌1.5 ml離心管中，-80℃低溫冰箱保存待測。

5.大鼠糞便腸道菌群總DNA提取及PCR檢測：按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取腸道菌群總DNA，并用紫外分光光度計檢測提取的DNA純度，A260/A280比值在1.8～2.0。選擇細(xì)菌16S rRNA-V3區(qū)的通用引物(V3-F/V3-R)對提取的腸道菌群總DNA進(jìn)行PCR擴增，使用50 μl PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(表1，10 μmol/L)各2 μl，dNTP(2.5 mmol/L)1 μl，MgCl2(2.5 mmol/L)5 μl，10×buffer 5 μl，Taq DNA(5 U/μl)0.4 μl，DNA模板2 μl，H2O 32.6 μl。上游引物5’端延伸添加GC夾(序列為CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)，產(chǎn)物為233 bp，有利于提高PCR產(chǎn)物在變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)中的分離效率。采用Touch down PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，65℃退火1 min(每2個循環(huán)退火溫度降低1℃，至退火溫度降到55℃)，72℃延伸1 min，共進(jìn)行20個循環(huán)；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，在此退火溫度再進(jìn)行10個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，電泳條件6 V/cm，30 min，采用溴化乙錠染色20 min，之后使用紫外成像分析系統(tǒng)拍照。

表1 大鼠腸道菌群V3區(qū)通用引物序列

6.DGGE檢測大鼠腸道菌群的變化：DGGE分析使用美國Bio-Rad公司DCode TMUni Versal Mutation檢測系統(tǒng)進(jìn)行，膠板大小為16 cm×10 cm×1 cm。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小選擇濃度為8%的聚丙烯凝膠，通過垂直變性梯度電泳確定最適用于本實驗PCR產(chǎn)物的變性梯度范圍(由上到下)為30%～65%，將1×TAE電泳緩沖液預(yù)熱至60℃后放入膠板，150 V電壓預(yù)電泳30 min后，取PCR擴增產(chǎn)物10 μl與6×上樣緩沖液混勻后注入上樣孔中，即可開始電泳：全程60℃，60 V電壓電泳1 h，之后以90 V電壓電泳14 h。待電泳完畢后，將板間的變性聚丙烯凝膠放入溴化乙錠溶液中染色20 min，在紫外下使用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，分析圖像。使用Quantity One(Bio-Rad，美國)對所得DGGE圖譜進(jìn)行軟件分析，檢測各組樣本的條帶數(shù)、灰度值等用于分析糞便細(xì)菌類型的多樣性。使用基于非加權(quán)配對算術(shù)平均法 (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)聚類分析各菌落相似性，計算出Dice相似性系數(shù)(Cs)。香農(nóng)指數(shù)(H’)是一反映微生物菌落多樣性的指數(shù)，值越大，說明菌群的多樣性越豐富。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠體重的比較

抑郁癥的臨床表現(xiàn)包括食欲不振。進(jìn)入實驗前和CUMS刺激第1周，實驗組大鼠體重與對照組無顯著差異(P>0.05)；CUMS刺激第2周～第4周，實驗組體重均較對照組顯著下降(均P<0.05)，且隨著時間的推移，體重不斷減輕(表2)。

表2 兩組大鼠進(jìn)行CUMS刺激前后體重的比較[g，(-±s)]

二、大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

快感缺乏、自發(fā)活動減少和絕望無助是抑郁癥的重要表現(xiàn)。糖水偏好實驗可以檢測大鼠是否有快感缺乏，曠場實驗可反映大鼠的自發(fā)活動，強迫游泳實驗可檢測大鼠是否具有絕望無助行為的表現(xiàn)。CUMS刺激4周后，與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠糖水消耗率顯著下降(P<0.05)，曠場中央?yún)^(qū)域活動距離顯著減少(P<0.05)，強迫游泳懸浮不動時間顯著延長(P<0.05)，提示 CUMS 抑郁造模成功(表3)。

表3 兩組大鼠行為學(xué)指標(biāo)的比較(-±s)

三、大鼠腸道菌群PCR擴增結(jié)果

選擇細(xì)菌16S rRNA-V3區(qū)的上、下游引物(V3-F-GC/V3-R)對提取的兩組大鼠腸道菌群總DNA進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物為233 bp；陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA，陰性對照未添加細(xì)菌DNA。結(jié)果在200 bp附近獲得清晰條帶，符合預(yù)期大小，為目的條帶(圖1)。

M：Marker；+：陽性對照；-：陰性對照； 1～5：對照組；6～10：實驗組圖1 兩組大鼠腸道菌群總DNA的PCR結(jié)果

四、大鼠腸道菌群的比較

DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)(H’)反應(yīng)腸道菌群的多樣性。實驗組大鼠DGGE條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均顯著低于對照組大鼠(P<0.01)；Dice相似性系數(shù)(Cs)可反映菌群相似性，實驗組大鼠組內(nèi)相似性顯著下降(P<0.01)，組間相似系數(shù)僅為(54.84±11.07)(表4)。

五、大鼠腸道菌群UPGMA聚類分析

將兩組大鼠腸道菌群DGGE指紋圖譜進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果顯示兩個組別樣本具有各自聚集的趨勢，提示每組個體的組內(nèi)相似性高于組間相似性，表明兩組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異，提示兩組之間相似性較低，實驗組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于紊亂(圖2)。相似系數(shù)累積分布曲線表示與對照組大鼠相比，實驗組大鼠個體間腸道菌群相似性顯著降低(曲線越靠近X 軸，組內(nèi)相似性越高)(圖3)。

表4 兩組大鼠腸道菌群的比較(-±s)

#1～#5：對照組；#6～#10：實驗組圖2 兩組大鼠腸道菌群DGGE圖譜UPGMA聚類分析

圖3 兩組大鼠腸道菌群相似性系數(shù)累積分布曲線

討 論

圍絕經(jīng)期是女性絕經(jīng)前后的一段時期，此時卵巢功能逐漸衰退，雌激素水平波動性下降引起植物神經(jīng)功能紊亂，出現(xiàn)一系列軀體及精神心理癥狀，稱圍絕經(jīng)期綜合征。具體表現(xiàn)為潮熱、出汗、心悸、疲乏、頭痛、失眠、情緒波動等特有癥狀，還易伴發(fā)焦慮、抑郁等多種心理問題。圍絕經(jīng)期是女性心理、社會、生物因素交互作用明顯的時期，抑郁發(fā)生率上升且達(dá)到峰值[12]。圍絕經(jīng)期抑郁女性的身體健康和生活質(zhì)量明顯下降，生活和工作受到嚴(yán)重困擾，甚至有些女性自殺。圍絕經(jīng)期女性對這一階段雌激素水平變化的敏感性增加是圍絕經(jīng)期抑郁發(fā)生的一個關(guān)鍵病因[13]。

腸道菌群種類繁多，數(shù)目龐大，已成為機體重要的組成部分，參與維持各項生理功能。腸道菌群對人類健康和疾病的影響已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注和重視[14-15]。研究證明，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物通過神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫途徑影響大腦，同時機體也通過此途徑調(diào)節(jié)腸道菌群的構(gòu)成，使腸道微生態(tài)保持平衡，即腸道微生物-腦-腸軸[16]，該學(xué)說認(rèn)為腸道菌群參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，且已在分子生物學(xué)中得到證實[17]。機體與腸道菌群之間有益的相互作用是機體建立和維持健康的關(guān)鍵，腸道菌群正常，可調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，影響機體的生長發(fā)育、生理功能和新陳代謝[18-19]。腸道菌群與年齡有關(guān)，從嬰兒至老年腸道菌群發(fā)生了巨大的變化[20]。機體受到嚴(yán)重打擊時腸道菌群也會發(fā)生變化，如乳桿菌數(shù)量減少[21]。圍絕經(jīng)期女性可出現(xiàn)一系列絕經(jīng)相關(guān)癥狀，加之處于所謂的“多事之秋”，易受外界因素影響從而更易引起消化系統(tǒng)微生物菌群的改變。研究報道已證實更年期綜合征婦女的腸道微生物菌群發(fā)生顯著變化[22]。

腸道菌群的組成和多樣性與抑郁密切相關(guān)[23]，抑郁動物模型證實了抑郁動物與正常動物腸道微生物具有明顯差異，這種差異與抑郁癥患者的腸道微生物失調(diào)具有相似性[24-25]。PCR結(jié)合DGGE技術(shù)為研究腸道微生態(tài)提供了便捷方法，廣泛用于腸道復(fù)雜微生物區(qū)系多樣性分析和菌群結(jié)構(gòu)變化的研究[26]。本研究對圍絕經(jīng)期抑郁大鼠的腸道菌群進(jìn)行PCR-DGGE試驗并進(jìn)行指紋圖譜分析，探討其腸道菌群的微生態(tài)狀況，發(fā)現(xiàn)與正常雌性圍絕經(jīng)期大鼠相比，接受CUMS刺激發(fā)生抑郁的雌性圍絕經(jīng)期大鼠，DGGE膠條帶數(shù)目和香農(nóng)指數(shù)顯著減少，說明腸道菌群多樣性顯著下降，Dice相似性系數(shù)提示組內(nèi)和組間的相似性顯著降低，表明菌群的穩(wěn)定性下降，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，趨于紊亂。最新研究報道調(diào)節(jié)腸道菌群改善腸道微生態(tài)可能成為抑郁治療的新靶點，開啟抑郁治療的新篇章[9]。應(yīng)用益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，可有效改善宿主焦慮、抑郁、認(rèn)知功能、自閉、應(yīng)激反應(yīng)等一系列神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)[27]，本研究結(jié)果啟發(fā)我們可以嘗試改善腸道微生態(tài)用以治療圍絕經(jīng)期抑郁。

腸道菌群有效參與調(diào)控機體的復(fù)雜生理過程，與機體的身心健康密切相關(guān)，本研究以圍絕經(jīng)期抑郁大鼠為模型，研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期抑郁大鼠腸道菌群紊亂，微生態(tài)失調(diào)，腸道菌群多樣性顯著降低，個體間和組間相似性也顯著降低，腸道微生態(tài)失調(diào)又會加重機體的生理平衡紊亂，導(dǎo)致情緒障礙加重或持續(xù)存在。越來越多的動物實驗證明益生菌的應(yīng)用有益于改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，我們可以嘗試改善圍絕經(jīng)期抑郁患者的腸道菌群，恢復(fù)益生菌的數(shù)量和功能，或許有益于抑郁的防治。