段智，鄧加雄，雷小保，李濤

(郴州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 郴州423000)

Glucagon like peptide-1(GLP-1)受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體B家族中的胰高血糖素受體亞家族。越來(lái)越多的研究表明，此受體除了在血糖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用外，在包括心血管、腎臟、神經(jīng)退行性病變等疾病中也發(fā)揮重要作用[1,2]。GLP-1受體廣泛分布于人體器官及組織中，在肺部表達(dá)也較為豐富[3]，但其在肺部疾病中的作用卻少見(jiàn)報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽在急性肺損傷中具有保護(hù)作用[3]，但機(jī)制不明確。細(xì)胞通過(guò)自噬清除功能缺失的細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)破壞的蛋白質(zhì)和侵入細(xì)胞的病原體等，從而發(fā)揮保護(hù)作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1類似物可以通過(guò)激活細(xì)胞自噬緩解帕金森病中神經(jīng)病變[5]。GLP-1可以通過(guò)上調(diào)自噬緩解糖尿病腎病的進(jìn)展[6]。可見(jiàn)GLP-1受體可能通過(guò)細(xì)胞自噬發(fā)揮其生理學(xué)作用。我們以往的研究證實(shí)，增強(qiáng)細(xì)胞自噬可以減輕膿毒癥急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[4]。因此，本研究繼續(xù)探討GLP-1受體膿毒癥ALI中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

TUNEL試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)南京)；兔抗大鼠Bax、Bcl-2、GAPDH、Beclin-1、P62單克隆抗體及二抗(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，中國(guó)武漢)；LC3單克隆抗體(美國(guó)Immunoway公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與分組

成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。參考以往研究建立ALI模型[7]，大鼠經(jīng)麻醉后，鈍性分離并暴露氣管，從氣管內(nèi)緩慢注射脂多糖(LPS，5 mg/kg)，并縫合。假模型大鼠在接受手術(shù)后，氣管內(nèi)僅注射0.5 ml生理鹽水(normal saline，NS)。

采用隨機(jī)數(shù)表法將30只大鼠隨機(jī)分為5組(每組6只)：對(duì)照組大鼠建立假模型5 min后接受0.5 ml NS處理；空白藥物組大鼠建立假模型5 min后接受GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽處理(2 mg/kg)[8]；模型組大鼠建立ALI模型5 min后接受NS處理(0.5 ml)；治療組大鼠建立ALI模型后5 min接受利拉魯肽處理(2 mg/kg)[8]；抑制劑組大鼠建立ALI模型后5 min接受利拉魯肽(2 mg/kg)及自噬抑制劑3-methyladenine(3MA，10 mg/kg)處理。大鼠在建立ALI模型12 h后處死，并檢查相關(guān)指標(biāo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肺損傷 處死后取右下肺于10%中性福爾馬林中固定、切片、脫蠟至HE染色，并參照以往研究評(píng)估肺損傷分?jǐn)?shù)[7]。

1.3.2 肺組織濕干重比 分離右上肺，用吸水紙吸干表面水分后稱量肺濕重，置于80℃烤箱72 h，稱量肺干重。計(jì)算肺組織濕干重比(wet to dry ratio, W/D)。肺W/D=肺濕重/肺干重。

1.3.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 分離肺組織，勻漿離心取上清，采用蛋白免疫印跡法，濃縮膠為5%，分離膠為10%，電泳后轉(zhuǎn)移到FVDF膜，一抗LC3B、P62、Beclin-1、Bax、Bcl-2、GAPDH 4℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。一抗僅有GAPDH是以1∶5 000稀釋度添加，其余均為1∶1 000稀釋度添加。免疫化學(xué)發(fā)光法曝光并進(jìn)行灰度值分析。

1.3.4 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 肺切片后，參照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，F(xiàn)ITC二抗標(biāo)記TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GLP-1受體對(duì)細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin-1表達(dá)增加，P62表達(dá)下降；與模型組比較，治療組大鼠肺組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ 及 Beclin-1表達(dá)顯著增加，P62表達(dá)顯著下降(均P<0.05；圖1，表1)。

表1 4組大鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

圖1 Western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白

2.2 GLP-1受體對(duì)肺損傷的影響

對(duì)照組及空白藥物組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常。與對(duì)照組比較，模型組肺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡壁明顯增厚，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，呈彌漫性間質(zhì)炎性改變，肺水腫及肺損傷分?jǐn)?shù)明顯增加。與模型組比較，治療組肺泡壁稍增厚，少量炎性細(xì)胞滲出，肺水腫及肺損傷分?jǐn)?shù)顯著下降。與治療組比較，抑制劑組肺泡壁增厚及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺水腫及肺損傷分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加(均P<0.05;圖2,表2)。

圖2 HE染色檢測(cè)肺組織病理變化

2.3 GLP-1受體對(duì)肺組織細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中Bax表達(dá)及凋亡細(xì)胞增加，Bcl-2表達(dá)下降；與模型組比較，治療組大鼠肺組織中Bax表達(dá)及凋亡細(xì)胞顯著下降，Bcl-2表達(dá)顯著增加；與治療組比較，抑制劑組大鼠肺組織Bax表達(dá)及凋亡細(xì)胞顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著下降(均P<0.05；圖3和4，表2)。

表2 5組大鼠肺損傷及細(xì)胞凋亡情況比較

圖3 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

圖4 TUNEL染色檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡

3 討 論

GLP-1受體不僅表達(dá)于胰腺，也表達(dá)于胰腺外組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、心血管、肺、腎臟、淋巴細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等組織[3]。大量研究表明，除了調(diào)節(jié)高血糖相關(guān)代謝性疾病，其在其他疾病的發(fā)展中扮演重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，激活GLP-1受體可以保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷[9]。GLP-1受體在肺部表達(dá)豐富[10]。有研究報(bào)道，GLP-1可以顯著降低阻塞性肺疾病大鼠的發(fā)病率及死亡率，激活GLP-1受體可以顯著改善急性肺損傷[3,8,11,12]。本研究同樣證實(shí)，GLP-1激動(dòng)劑可以顯著減輕LPS介導(dǎo)的肺損傷，這與上述研究結(jié)果是相符的。但盡管如此，激活GLP-1受體減輕肺損傷的機(jī)制尚不明確。

以往研究已證實(shí)，上調(diào)細(xì)胞自噬可以顯著減輕ALI[4]。而GLP-1受體對(duì)于細(xì)胞自噬的影響也有相關(guān)報(bào)道[13]。GLP-1類似物通過(guò)AMPK/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)肝臟脂質(zhì)積累[14]。激活GLP1受體可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬，減輕細(xì)胞凋亡，從而緩解2型糖尿病患者慢性神經(jīng)病變[15]。從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床試驗(yàn)，都有數(shù)據(jù)證實(shí)基于GLP-1的治療可以促進(jìn)心臟代謝異常患者的細(xì)胞自噬水平[16]。盡管如此，在肺部疾病中，GLP-1對(duì)細(xì)胞自噬的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)激活GLP-1受體可以顯著上調(diào)肺組織中LC3II/I、Beclin-1及下調(diào)P62表達(dá)，提示自噬水平增強(qiáng)，這是首次證明GLP-1受體對(duì)ALI中自噬水平有影響。細(xì)胞自噬通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器、失調(diào)的蛋白質(zhì)及異物等，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，這對(duì)于細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激狀態(tài)是非常關(guān)鍵的。為了探討GLP-1受體是否通過(guò)細(xì)胞自噬減輕ALI，本研究使用了自噬的特異性抑制劑3MA。本研究結(jié)果表明，抑制細(xì)胞自噬可以顯著抑制激活GLP-1受體對(duì)肺損傷及細(xì)胞凋亡的影響。

綜上，激活GLP-1受體可以顯著減輕脂多糖介導(dǎo)的急性肺損傷，其機(jī)制可能與其通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬、進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。