閆禹竹,肖 飛△,崔永會,焦志勤

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱市南崗區(qū)革新社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，黑龍江 哈爾濱 150000； 3.哈爾濱理工大學，黑龍江 哈爾濱 150000)

癲癇是以腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致的發(fā)作性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的慢性腦部疾病。其中近一半的癲癇病人可伴有認知功能特別是學習記憶功能障礙[1]。因此，近年來如何治療癲癇伴學習記憶等認知功能障礙成為神經(jīng)科學的研究熱點之一。本課題通過觀察天麻素穴位注射對戊四氮致癇模型大鼠行為學及腦組織海馬區(qū)COX-2 mRNA表達的變化，探討天麻素穴注的抗癇及神經(jīng)保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供120只健康Wistar雄性大鼠，SPF級，體質(zhì)量250～325 g。采用隨機數(shù)字表法將尾部標記編號的實驗大鼠分為空白組、模型組、穴注組及西藥組，每組各30只。

1.2 實驗藥物及試劑

按等效劑量比例換算方法，穴注天麻素(昆明制藥集團股份有限公司,批號：H20013046,規(guī)格：0.2 g/支)成人用量：0.088 6 mL/kg，換算后實驗大鼠用量：0.37 mL/kg；丙戊酸鈉片(山東仁和堂有限公司，批號：H19983059，規(guī)格:0.2 g/片)放置于4 ℃環(huán)境下遮光保存；戊四氮(PTZ，美國Sigma公司，貨號：Sigma-p6500)配制成戊四氮溶液(PTZ溶液，濃度：2 mg/mL)；10%水合氯醛溶液；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PCR擴增儀(MJ Research公司)。

1.3 造模方法

除空白組外，每日上午8：30—11：30模型組、穴注組及西藥組大鼠腹腔注射PTZ溶液35 mg/kg，空白組給予等劑量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)注射28 d以點燃戊四氮癲癇大鼠動物模型。每次注射治療后，觀察模型大鼠的行為學變化1 h，并根據(jù)Racine分級[2]判斷評估及記錄大鼠癲癇發(fā)作的級別。對實驗大鼠可能發(fā)生的意外情況進行干預(yù)。在造模周期28 d內(nèi)連續(xù)5 d出現(xiàn)Ⅳ級及以上的癇性發(fā)作，視為戊四氮癲癇大鼠造模成功，對于達不到造模標準或死亡大鼠予以剔除并補充相應(yīng)數(shù)目大鼠以保證大鼠樣本量恒定。

1.4 處置方法

穴注組在造模成功后，參照《實驗針灸學》[3]及《大鼠穴位圖譜的研制》[4]，定位大鼠百會穴及大椎穴，給予標記，將天麻素溶液按0.37 mL/kg的給藥劑量分別注射入模型大鼠百會穴及大椎穴，連續(xù)治療28 d；西藥組在造模成功后，給予丙戊酸鈉溶液(350 mg/kg)灌胃，日1次，連續(xù)治療28 d。

1.5 取材

Morris水迷宮及八臂迷宮試驗結(jié)束后，對模型大鼠進行麻醉、固定、斷頭等處理，將實驗大鼠的腦組織海馬區(qū)迅速分離取材，將體積1 mm3大小組織塊置于2.5%戊二醛固定液中前固定，保存標本，常規(guī)處理并按操作說明書以實時熒光定量PCR法檢測COX-2 mRNA表達。

1.6 觀察指標

1.6.1 全面強直發(fā)作-陣攣發(fā)作潛伏期和極小陣攣發(fā)作潛伏期 每次給予各組大鼠PTZ腹腔注射后，參照Racine分級，觀察大鼠極小陣攣發(fā)作(MCS)潛伏期及全面性強直-陣攣發(fā)作(GTCS)潛伏期[5]。

1.6.2 Morris水迷宮試驗 對各組實驗大鼠進行Morris水迷宮試驗檢測大鼠的空間學習記憶能力。最后1次治療結(jié)束后，每組大鼠再隨機選出10只大鼠進行Morris水迷宮試驗并記錄實驗大鼠尋找并爬上平臺所需的時間以及穿越平臺象限的次數(shù)。

1.6.3 八臂迷宮試驗 對各組大鼠進行八臂迷宮試驗檢測大鼠與海馬相關(guān)的工作記憶錯誤和參考記憶錯誤。治療結(jié)束后，各組大鼠再隨機選出10只大鼠進行八臂迷宮試驗，并記錄大鼠在八臂迷宮中的覓食情況，包括參考記憶錯誤次數(shù)、工作記憶錯誤次數(shù)、吃完食物所需總時間。

1.6.4 檢測COX-2 mRNA的表達 實時熒光定量PCR法檢測COX-2 mRNA在大鼠海馬組織的表達。實驗大鼠海馬組織取材后，去RNA酶離心管中加入30 mg海馬組織，同時加入Trizol試劑1 mL，剪碎、迅速勻漿、氯仿抽提、振蕩混勻、離心、移入去RNA酶離心管。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用重復(fù)測量的多因素方差分析進行統(tǒng)計。P<0.05表示有統(tǒng)計學差異，P<0.01表示有差異顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2.1.1 全面性強直-陣攣發(fā)作潛伏期(GTCS) 與模型組對比，穴注組及西藥組大鼠GTCS均顯著延長(P<0.01)；穴注組與西藥組對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？瞻捉M大鼠未出現(xiàn)癇性發(fā)作。

2.1.2 極小陣攣發(fā)作潛伏期(MCS) 與模型組對比，穴注組及西藥組大鼠MCS均顯著延長(P<0.01)；穴注組與西藥組對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。空白組大鼠未出現(xiàn)癇性發(fā)作。見表1。

表1 各組戊四氮致癇大鼠全面強直發(fā)作-陣攣發(fā)作(GTCS)潛伏期和極小陣攣發(fā)作(MCS)潛伏期比較

2.2 各組Morris水迷宮試驗比較

各組實驗大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺游泳軌跡策略如圖1所示，經(jīng)訓練后，空白組大鼠游泳軌跡表現(xiàn)為直線式有效策略；模型組大鼠游泳軌跡表現(xiàn)為以隨機式為主，并且具極大盲目性；穴注組大鼠表現(xiàn)為趨向式的有效策略；西藥組以邊緣式為主。

圖1 各組大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺游泳軌跡策略圖

模型組與空白組相比，實驗大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組大鼠與空白組相比，在空間探索試驗中穿越平臺數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；穴注組及西藥組大鼠與模型組相比，逃避潛伏期時間均較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),穿越平臺數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；穴注組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 Morris水迷宮試驗各組大鼠逃避潛伏期與穿越平臺次數(shù)比較

2.3 各組八臂迷宮試驗比較

與空白組比較，模型組、穴注組、西藥組數(shù)據(jù)均有差異，參考記憶錯誤次數(shù)、工作記憶錯誤次數(shù)均顯著增多(P<0.01)，吃完食物總時間模型組及西藥組顯著增多(P<0.01)、穴注組增多(P<0.05)。穴注組及西藥組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠八臂迷宮試驗比較

2.4 各組COX-2 mRNA在大鼠海馬組織表達比較

各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達水平以β-actin作內(nèi)參。與空白組相比，模型組大鼠COX-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)，穴注組、西藥組大鼠COX-2 mRNA表達水平升高(P<0.05)；與模型組對比，穴注組、西藥組干預(yù)后均降低COX-2 mRNA的表達水平(P<0.05)；穴注組與西藥組對比，大鼠海馬胞漿內(nèi)COX-2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達

圖2 各組大鼠海馬組織COX-2 mRNA表達

3 討論

癲癇是在神經(jīng)功能紊亂疾病中所占比例最高的慢性臨床綜合征[6]，其中部分癲癇患者會伴隨有不同程度的認知功能障礙以及學習記憶功能障礙，在學習記憶能力中又以視覺空間記憶能力以及長、短時記憶能力損傷最為嚴重[7]。研究發(fā)現(xiàn)在癲癇治療方面，中藥單體及復(fù)方制劑發(fā)揮著非常重要的作用[7]。天麻為蘭科植物，具有熄風定驚功效?！度杖A子本草》云:“助陽氣，補五勞七傷，通血脈，開竅?！薄侗窘?jīng)》記載:“主惡氣，久服益氣力，長陰肥健。”現(xiàn)代研究表明天麻超微粉對血管性癡呆模型大鼠學習記憶功能的降低有改善作用，可能與調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)促進神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放有關(guān)[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)天麻對創(chuàng)傷性腦損傷所致血腦屏障滲漏及腦水腫均有減輕，可能通過減少神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細胞活化使神經(jīng)干細胞增殖，進而改善損傷后導(dǎo)致的認知及運動功能障礙[9]。王氏等總結(jié)多項研究證實天麻單藥具有緩解認知障礙、神經(jīng)保護作用、抗阿爾茲海默病、抗氧化、抗驚厥、抗癲癇及腦保護作用[10]。穴位注射療法是在傳統(tǒng)毫針針刺基礎(chǔ)上發(fā)展而來，較以往傳統(tǒng)針刺療法，穴注可將提純藥物采用針刺輸注手段直接作用于穴位，臨床上取得更為理想療效。臨床上本研究團隊已應(yīng)用天麻單藥及復(fù)方制劑治療癲癇及癲癇后伴認知障礙患者多年，且通過實驗研究發(fā)現(xiàn)天麻素穴注可有效抑制癇性發(fā)作，并調(diào)控抗凋亡因子Bcl-2及凋亡因子Caspase-3的表達，進而發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護作用[11]。

本研究水迷宮試驗顯示模型組大鼠潛伏期較空白組數(shù)據(jù)明顯延長、穿越平臺數(shù)減少，八臂迷宮試驗示模型組大鼠較空白組大鼠數(shù)據(jù)參考記憶錯誤次數(shù)和工作記憶錯誤次數(shù)均顯著增多、吃完食物總時間顯著延長，證明造模后癲癇大鼠已經(jīng)出現(xiàn)學習記憶能力、工作記憶、參考記憶能力下降，存在認知功能障礙的表現(xiàn)。穴注組和西藥組與模型組實驗大鼠數(shù)據(jù)進行比較，潛伏期明顯縮短、穿越平臺次數(shù)增加、參考記憶錯誤次數(shù)、工作記憶錯誤次數(shù)均減少、吃完食物總時間縮短，表明穴注和西藥均可對癲癇大鼠認知、記憶力有一定的改善作用。目前，在AEDs治療基礎(chǔ)上，添加中藥輔助治療癲癇已經(jīng)成為了一種研究和應(yīng)用的趨勢，本研究結(jié)果穴注組及西藥組兩組學習記憶能力數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義，但穴注組數(shù)據(jù)優(yōu)于西藥組，提示在后續(xù)研究中關(guān)注中藥不同劑量、干預(yù)治療時長對癲癇大鼠認知功能障礙的治療差異。

COX-2作為前列腺素E2代謝產(chǎn)生過程的關(guān)鍵酶和限速酶，前列腺素E2參與炎癥、凋亡等多種病理過程，COX-2主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，參與介導(dǎo)神經(jīng)元損傷[12-13]。在癲癇發(fā)作、炎癥反應(yīng)發(fā)生及腦外傷刺激后，COX-2能夠通過合成 PGE2進而調(diào)節(jié)細胞膜興奮性、增強細胞膜通透性及異常興奮性信號傳導(dǎo)而誘發(fā)細胞的損傷[14]。研究顯示應(yīng)用COX-2抑制劑能明顯抑制癲癇大鼠的癇性發(fā)作的發(fā)作頻率及發(fā)作持續(xù)時間，并且減輕腦組織損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)戊四氮致癇大鼠海馬組織COX-2mRNA表達明顯增強，由此推測，COX-2的異常表達可能參與了癲癇發(fā)病中的氧化應(yīng)激損傷以及海馬神經(jīng)元死亡或凋亡過程，天麻素可能通過調(diào)節(jié)COX-2的異常表達，進而具有抗氧化損傷、抗凋亡的腦保護作用。

綜上所述，本研究證實天麻素穴注延長戊四氮致癇大鼠GTCS潛伏期和MCS潛伏期、改善認知功能，其機制可能是通過調(diào)節(jié) COX-2的異常表達發(fā)揮其改善大鼠認知障礙及神經(jīng)保護功能，該研究結(jié)果為臨床癲癇疾病的治療及改善癲癇后認知障礙均提供了新的治療思路。