繆玖麟，王建榮，徐志敏，邱衛(wèi)明，陳保華，李新建

乳腺癌是一種常見的癌癥，是世界范圍內(nèi)女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1］。順鉑作為一種高效廣譜的抗癌藥物，其通過與DNA 交聯(lián)，阻斷DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在乳腺癌的臨床化療中發(fā)揮著重要作用［2］。然而，隨著順鉑在臨床化療中的長期重復(fù)使用，將不可避免地引起乳腺癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性［3］。近年來的研究表明，微小RNA（miRNA）的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的順鉑耐藥有關(guān)。如上調(diào)微小RNA-192（miR-192）［4］、微小RNA-34a（miR-34a）［5］或下調(diào)微小 RNA-19a（miR-19a）［6］可提高腫瘤細(xì)胞的順鉑敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性。微小RNA-25-3p（miR-25-3p）是微小RNA-106b（miR-106b）家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p通過靶向信號素4C（Sema4C）可增加宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［7］。甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域 5（GDPD5）位于 11q13.5 位置，研究發(fā)現(xiàn)，GDPD5 除具有滲透調(diào)節(jié)甘油磷酸膽堿的生理作用外，其還是乳腺癌腫瘤發(fā)生的陽性調(diào)控因子［8-9］。此外，有研究報(bào)道，沉默GDPD5 可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的順鉑敏感性［10］。因此，2018 年 10 月至 2019 年 6月，本研究通過檢測乳腺癌順鉑耐藥（MCF-7/DDP）細(xì)胞中miR-25-3p和GDPD5的變化，探討miR-25-3p及GDPD5調(diào)控乳腺癌細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，Hyclone公司；LipofectamineTM2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑，Invitrogen公司；順鉑（DDP），齊魯制藥有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）和二甲基亞砜（DMSO試劑），Sigma公司；蛋白質(zhì)印跡法相關(guān)試劑，上海碧云天公司；引物、miR-25-3p過表達(dá)載體（miR-25-3p mimics）、miR-25-3p過表達(dá)空載體（miR-con）、GDPD5過表達(dá)載體（pcDNA-GDPD5）、GDPD5 過表達(dá)載體（pcDNA-con）、miR-25-3p抑制表達(dá)空載體（anti-miR-con）、miR-25-3p 抑制表達(dá)載體（anti-miR-25-3p）、GDPD5 野生型熒光素酶報(bào)告載體（WT-GDPD5）和GDPD5突變型熒光素酶報(bào)告載體（MUT-GDPD5）的構(gòu)建和測序，北京華大基因有限公司；β-actin抗體，Santa Cruz公司；甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域5（GDPD5）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶π（GST-π）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗體和HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞MCF-7/DDP 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、濕度飽和、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱。miR-25-3p 過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的MCF-7/DDP細(xì)胞按照每孔2×105細(xì)胞接種于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至50%～60%時(shí)，利用LipofectamineTM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)為NC組（正常培養(yǎng)的MCF-7/DDP細(xì)胞）、miR-con組（轉(zhuǎn)染miR-con）和miR-25-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimics）。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。同時(shí)設(shè)置DDP干預(yù)組，用不同終濃度DDP（60、120、240、480、960 μmol/mL）處理各組細(xì)胞24 h后，檢測各組細(xì)胞的生長抑制率。

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-25-3p通過調(diào)控GDPD5表達(dá)影響MCF-7/DDP細(xì)胞的增殖和對順鉑的耐藥性，將miR-25-3p mimics 和 pcDNA-GDPD5 同時(shí)轉(zhuǎn)入 MCF-7/DDP 細(xì)胞，檢測MCF-7/DDP 細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)分為miR-25-3p+pcDNA-con組（miR-25-3p mimics和pcDNA-con共轉(zhuǎn)染）和miR-25-3p+pcDNA-GDPD5組（miR-25-3p mimics 和pcDNA-GDPD5 共轉(zhuǎn)染）。同時(shí)設(shè)置DDP干預(yù)組，方法同上。

1.3 qRT-PCR 檢測利用TRIzol 試劑分別提取MCF-7、MCF-7/DDP 和各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的總RNA，檢測其濃度后，取適量RNA將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green real-time PCR 方法檢測 miR-25-3p（以U6為參照）、GDPD5 mRNA和GST-π mRNA（以β-actin為參照）的表達(dá)，按照2-ΔΔCt法計(jì)算其相對表達(dá)量。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測TargetScan軟件預(yù)測顯示，miR-25-3p 與GDPD5 存在部分特異性結(jié)合位點(diǎn)，GDPD5可能是miR-25-3p的潛在靶基因，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建野生型 WT-GDPD5 和突變型 MUT-GDPD5 的 GDPD5-3’UTR 熒光素酶報(bào)告基因載體，利用LipofectamineTM2000 將 miR-25-3p mimics 和 miR-con 分 別 與 WTGDPD5 或 MUT-GDPD5 轉(zhuǎn)染到 MCF-7/DDP 細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h后，檢測各組MCF-7/DDP細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活力取生長良好的MCF-7/DDP細(xì)胞和各轉(zhuǎn)染組MCF-7/DDP細(xì)胞，按照每孔2×103細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液為含DDP 的培養(yǎng)液（DDP 終濃度分別為60、120、240、480、960 μmol/mL），另分別設(shè)置不加DDP組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液15μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄去各孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每孔加入150μL的DMSO，繼續(xù)孵育2 h后，490 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率或細(xì)胞抑制率。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測消化收集各組細(xì)胞，用適量的RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心 30 min 收集細(xì)胞蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，并將各組蛋白稀釋至相等濃度。經(jīng)過SDS-PAGE 電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，稀釋的抗GDPD5、CyclinD1 和 GST-π 蛋白的Ⅰ抗室溫孵育 2 h，洗膜后稀釋的Ⅱ抗孵育2 h，用ECL 試劑盒于暗處顯影，并利用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，分析目的條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)均用±s 表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，總體有差異進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-25-3p、GDPD5 和GST-π 在正常乳腺細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)圖1和表1顯示，與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7/DDP細(xì)胞miR-25-3p 的表達(dá)顯著下調(diào)，GDPD5 mRNA、GDPD5蛋白、GST-π mRNA 和GST-π 蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05）。提示，miR-25-3p、GDPD5 和GST-π 的異常表達(dá)可能與乳腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥有關(guān)。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5、GST-π蛋白的表達(dá)量

2.2 miR-25-3p過表達(dá)對MCF-7/DDP細(xì)胞增殖的影響圖2和表2顯示，與miR-con 組相比，miR-25-3p 組 MCF-7/DDP 細(xì)胞 miR-25-3p 的表達(dá)顯著升高，表明成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-25-3p的MCF-7/DDP細(xì)胞株。與miR-con組比較，miR-25-3p組MCF-7/DDP細(xì)胞CyclinD1 和GST-π 蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。表明，過表達(dá)miR-25-3p可抑制MCF-7/DDP細(xì)胞增殖。

表1 用qRT-PCR檢測GDPD5 mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5、GST-π蛋白的表達(dá)量/±s

表1 用qRT-PCR檢測GDPD5 mRNA的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5、GST-π蛋白的表達(dá)量/±s

注：MCF-7為乳腺癌細(xì)胞，MCF-7/DDP為乳腺癌順鉑耐藥性細(xì)胞，miR-25-3p為微小RNA-25-3p，GDPD5 mRNA為甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域5mRNA，GST-π mRNA為胎盤型谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶π mRNA，GDPD5 protein為甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域5蛋白，GST-π protein為胎盤型谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶π蛋白

細(xì)胞MCF-7 MCF-7/DDP t 值P 值重復(fù)次數(shù)99 miR-25-3p 1.00±0.10 0.26±0.03 12.348 0.000 GDPD5 mRNA 1.02±0.16 2.89±0.29 12.500 0.000 GST-πmRNA 1.02±0.10 2.12±0.20 14.758 0.000 GDPD5 protein 0.95±0.10 1.50±0.16 8.745 0.000 GST-πprotein 0.41±0.06 1.15±0.11 17.718 0.000

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測CyclinD1和GST-π蛋白的表達(dá)

表2 miR-25-3p過表達(dá)抑制MCF-7/DDP增殖/±s

表2 miR-25-3p過表達(dá)抑制MCF-7/DDP增殖/±s

注：NC為乳腺癌耐藥細(xì)胞未做處理組；miR-con為空載體處理組；miR-25-3p為miR-25-3p過表達(dá)轉(zhuǎn)染處理組；CyclinD1為G1/S-特異性周期蛋白-D1；GST-π為胎盤型谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶π。與miR-con組比較，at=18.596，15.740，16.877，12.005，P=0.000，0.000，0.000，0.000

組別NC miR-con miR-25-3p F 值P 值重復(fù)次數(shù)999 miR-25-3p 1.00±0.10 1.02±0.15 2.56±0.25a 227.634 0.000 CyclinD1 1.10±0.11 1.12±0.11 0.40±0.05a 170.023 0.000 GST-π 1.12±0.11 1.15±0.12 0.35±0.04a 197.584 0.000細(xì)胞存活率/%100.00±10.16 100.00±10.11 50.36±5.04a 96.072 0.000

2.3 miR-25-3p過表達(dá)對MCF-7/DDP細(xì)胞順鉑的耐藥性的影響表3 顯示，與miR-con 組比較，miR-25-3p組MCF-7/DDP細(xì)胞的生長抑制率顯著增加（P＜0.05），且呈一定的劑量依賴性。這表明過表達(dá)miR-25-3p可提高M(jìn)CF-7/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性。

表3 miR-25-3p過表達(dá)聯(lián)合不同濃度DDP處理對MCF-7/DDP細(xì)胞的生長抑制率/（%，xˉ±s)

2.4 miR-25-3p 靶向調(diào)控GDPD5 的表達(dá)TargetScan 軟件預(yù)測顯示，見圖 3A，miR-25-3p 和GDPD5 之間存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)。表4 顯示，當(dāng)上調(diào)miR-25-3p表達(dá)后，轉(zhuǎn)染GDPD5-WT的3’-UTR 報(bào)告基因的MCF-7/DDP 細(xì)胞的相對熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染GDPD5-MUT 的3’-UTR 報(bào)告基因的MCF-7/DDP 細(xì)胞的相對熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）。表5 顯示，當(dāng)上調(diào)miR-25-3p表達(dá)后，MCF-7/DDP細(xì)胞GDPD5蛋白的表達(dá)量顯著降低；當(dāng)下調(diào) miR-25-3p 表達(dá)后，MCF-7/DDP 細(xì)胞GDPD5 蛋白的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，miR-25-3p可靶向負(fù)性調(diào)控GDPD5的表達(dá)。

圖3 miR-25-3p靶向GDPD5，調(diào)控GDPD5表達(dá)：A為生物信息軟件預(yù)測miR-25-3p與GDPD5靶向關(guān)系，B為蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5蛋白表達(dá)量

表4 miR-con或miR-25-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7/DDP細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測/±s

注：miR-con為過表達(dá)空載體處理組,miR-25-3p為miR-25-3p過表達(dá)轉(zhuǎn)染處理組,WT 為GDPD5 野生型報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,MUT 為GDPD5突變型報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

組別miR-con miR-25-3p t 值P 值重復(fù)次數(shù)99熒光素酶活性WT 1.01±0.11 0.35±0.05 16.387 0.000 MUT 1.03±0.11 1.00±0.10 0.605 0.553

2.5 過表達(dá)GDPD5 可以部分逆轉(zhuǎn)miR-25-3p 對MCF-7/DDP細(xì)胞增殖和順鉑耐藥性的影響圖4、表 6 和表 7 顯示，與 miR-con 組相比，miR-25-3p 組MCF-7/DDP 細(xì)胞 GDPD5、CyclinD1 和GST-π 蛋白的表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞存活率顯著降低，MCF-7/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著降低；與miR-25-3p+pcDNA-con組相比，miR-25-3p+pcDNA-GDPD5組MCF-7/DDP 細(xì)胞 GDPD5、CyclinD1 和 GST-π 蛋白的表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞存活率顯著升高，MCF-7/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性顯著升高（P＜0.05）。這表明miR-25-3p通過下調(diào)GDPD5的表達(dá)提高M(jìn)CF-7/DDP細(xì)胞的順鉑敏感性。

表5 蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5的表達(dá)/±s

表5 蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5的表達(dá)/±s

注：GDPD5為為甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域5蛋白，miR-con為過表達(dá)空載體處理組，miR-25-3p 為轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-25-3p 處理組，anti-miR-con為低表達(dá)空載體處理組，anti-miR-25-3p為miR-25-3p低表達(dá)轉(zhuǎn)染組。與 miR-con 組比較，at=11.853，P=0.000，與 anti-miR-con組比較，bt=12.262，P=0.000

組別miR-con miR-25-3p anti-miR-con anti-miR-25-3p F 值P 值重復(fù)次數(shù)9999 GDPD5 1.00±0.10 0.42±0.05a 0.95±0.09 1.55±0.15b 178.135 0.000

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測GDPD5、CyclinD1和GST-π蛋白的表達(dá)

3 討論

自從1978年順鉑首次被用于治療睪丸癌以來，至今已有40余年。然而，由于順鉑在惡性腫瘤中的長期且重復(fù)使用，導(dǎo)致了嚴(yán)重的耐藥性。腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥主要與以下幾種機(jī)制有關(guān)［11］：谷胱甘肽（GSH）及其轉(zhuǎn)移酶（GST-π）的過量表達(dá)對化療藥物的解毒作用；腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑異常；腫瘤細(xì)胞增加對胞內(nèi)順鉑的泵出；減少進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的順鉑量。最近的研究表明，調(diào)控miRNAs 的表達(dá)水平在一定程度上可提高順鉑抗性腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑的治療效果［12-13］。

表6 過表達(dá)GDPD5可以部分逆轉(zhuǎn)miR-25-3p對MCF-7/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用/±s

表6 過表達(dá)GDPD5可以部分逆轉(zhuǎn)miR-25-3p對MCF-7/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用/±s

注：本試驗(yàn)重復(fù)9次，GDPD5為甘油磷酸二酯酶磷酸結(jié)構(gòu)域5蛋白，GST-π 為胎盤型谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶π，CyclinD1 為G1/S-特異性周期蛋白-D1，miR-con為空載體處理組，miR-25-3p為過表達(dá)miR-25-3p轉(zhuǎn)染組，miR-25-3p+pcDNA-con為過表達(dá)miR-25-3p和pcDNA-con 空載體共轉(zhuǎn)染組，miR-25-3p+pcDNA-GDPD5 為 miR-25-3p 和GDPD5 過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組。與 miR-con 組比較，at=22.831，18.708，15.000，14.651，均 P＜0.001，與 miR-25-3p+pcDNA-con 組比較，bt=17.231，13.096，12.400，10.470，均P＜0.001

組別miR-con miR-25-3p miR-25-3p+pcDNA-con miR-25-3p+pcDNA-GDPD5 F 值P 值GDPD5 1.48±0.13 0.42±0.05a 0.45±0.05 1.25±0.13b 275.814 0.000 CyclinD1 1.10±0.11 0.40±0.05a 0.42±0.05 0.91±0.09b 177.274 0.000 GST-π 1.13±0.12 0.38±0.04a 0.40±0.13 1.02±0.11b 126.793 0.000細(xì)胞存活率/%100.00±10.01 48.24±4.82a 50.17±5.02 87.16±8.72b 109.677 0.000

miR-25-3p定位于人基因組7號染色體，是miR-106b-25 簇成員之一。有研究顯示，miR-25-3p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，且miR-25-3p 通過靶向FBXW7 和DKK3 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移［14］。然而，miR-25-3p 在舌鱗癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-25-3p 通過抑制cyclinD1、蛋白激酶B（AKT）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）等蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（p27）蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［15］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p 在順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，上調(diào)miR-25-3p通過靶向Sema4C抑制順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞異種移植瘤的生長，逆轉(zhuǎn)宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞的EMT 表型，增強(qiáng)對順鉑的敏感性［7］。膽堿磷脂代謝異常是腫瘤的一個(gè)新特征，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16］。最近的研究表明，GDPD5 在乳腺腫瘤細(xì)胞和惡性程度較高的雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞中呈過表達(dá)，沉默GDPD5可改變?nèi)橄侔┠Ｐ腕w內(nèi)磷脂代謝產(chǎn)物的分布［17］。同時(shí)，Cao 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，沉默GDPD5 可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，F(xiàn)eng 等［10］研究表明，miR-195-5p通過靶向下調(diào)GDPD5誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性。提示miR-25-3p和GDPD5與腫瘤細(xì)胞的耐藥明顯相關(guān)。

表7 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件聯(lián)合不同濃度DDP處理對MCF-7/DDP生長抑制率的影響/（%，±s）

表7 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件聯(lián)合不同濃度DDP處理對MCF-7/DDP生長抑制率的影響/（%，±s）

注：miR-con為空載體處理組，miR-25-3p為過表達(dá)miR-25-3p轉(zhuǎn)染組，miR-25-3p+pcDNA-con為過表達(dá)miR-25-3p和pcDNA-con空載體共轉(zhuǎn)染組，miR-25-3p+pcDNA-GDPD5 為miR-25-3p 和GDPD5 過表達(dá)共轉(zhuǎn)染組;與miR-con 組比較，at=16.371，15.671，20.948，14.703，12.030，均P＜0.001；與miR-25-3p+pcDNA-con組比較，bt=11.221，10.646，15.544，10.976，8.981，均P＜0.001

組別miR-con miR-25-3p miR-25-3p+pcDNA-con miR-25-3p+pcDNA-GDPD5 F 值P 值重復(fù)次數(shù)9 9 9 9 DDP/（μmol/mL）60 12.46±1.21 26.13±2.06a 27.16±2.15 17.79±1.49b 140.980 0.000 120 18.56±1.53 36.18±3.01a 37.49±2.79 25.52±1.89b 128.647 0.000 240 38.25±2.61 72.13±3.89a 70.28±4.01 45.14±3.01b 228.429 0.000 480 50.35±3.88 85.26±5.26a 83.18±5.38 57.12±5.46b 112.862 0.000 960 63.79±4.96 93.26±6.01a 92.46±5.58 70.46±4.02b 76.082 0.000

本研究結(jié)果顯示，MCF-7/DDP 細(xì)胞中miR-25-3p 的表達(dá)較對順鉑敏感的MCF-7 細(xì)胞顯著下調(diào)，MCF-7/DDP 細(xì)胞中GDPD5 的表達(dá)較對順鉑敏感的MCF-7 細(xì)胞顯著上調(diào)。GST-π 是藥物代謝的功能酶，GST-π 可加速抗腫瘤藥物的降解，增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性［19］。我們發(fā)現(xiàn)MCF-7/DDP 細(xì)胞中GST-π 的表達(dá)較MCF-7 細(xì)胞顯著上調(diào)。提示miR-25-3p、GDPD5 和 GST-π 可能參與調(diào)控 MCF-7 細(xì)胞對順鉑的耐藥。隨后，我們用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法上調(diào)miR-25-3p，發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-25-3p 可抑制 CyclinD1 和GST-π蛋白表達(dá)，抑制MCF-7/DDP細(xì)胞增殖，并提高M(jìn)CF-7/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性。TargetScan 在線預(yù)測顯示，GDPD5 是miR-25-3p 的潛在靶基因。同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，miR-25-3p 可靶向負(fù)性調(diào)控GDPD5 的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-25-3p 通過靶向下調(diào)GDPD5 表達(dá)參與對MCF-7/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的調(diào)控，進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GDPD5 可以部分逆轉(zhuǎn)miR-25-3p 對MCF-7/DDP細(xì)胞增殖、CyclinD1 和 GST-π 蛋白表達(dá)的抑制作用，增強(qiáng)MCF-7/DDP 細(xì)胞對順鉑的耐藥性。提示，miR-25-3p 通過靶向調(diào)控下調(diào)GDPD5 表達(dá)抑制細(xì)胞存活，進(jìn)而降低MCF-7/DDP 細(xì)胞對順鉑的耐藥性。

綜上所述，miR-25-3p 通過靶向下調(diào)GDPD5 表達(dá)，降低MCF-7/DDP 細(xì)胞對順鉑的耐藥性。上調(diào)miR-25-3p有望為順鉑耐藥乳腺癌的治療提供新的思路。