張偉，趙衛(wèi)華，徐云興，王紅坡

梗阻性黃疸（Obstructive Jaundice，OJ）是指膽道系統(tǒng)發(fā)生梗阻后，導致膽紅素或游離膽紅素返流入血，并出現(xiàn)鞏膜黃染的現(xiàn)象［1-2］。王婷、許衛(wèi)娜［3］研究表明：持續(xù)性的OJ 對肝臟有較大的影響，嚴重會導致肝臟纖維化和肝硬化。目前使用中藥治療OJ效果較為突出［4］。中醫(yī)認為黃疸濕熱結于脾胃，熏蒸肝膽，故治則不外清熱利濕［5］。茵陳五苓散中包含茵陳、澤瀉、茯苓片、豬苓、白術、桂枝等藥物，可以提高機體的抗氧化作用同時防止肝臟纖維化和肝炎。本研究旨在探究茵陳五苓散對實驗性OJ 大鼠肝損傷的保護作用及保護機理。

茵陳五苓散對實驗性梗阻性黃疸大鼠肝損傷的保護作用

1 材料與儀器

1.1 動物2017年1月至2019年5月，60只SPF級雄性SD 大鼠，購自廣東省醫(yī)學動物實驗中心，粵監(jiān)證字2004A029號，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，本研究經過倫理委員會批準且遵循動物實驗3-R原則。

1.2 藥物與試劑茵陳、澤瀉、茯苓片、豬苓、白術、桂枝，均購自武漢市中醫(yī)院；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒購自江萊生物有限公司；B淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，貨號 sc-56015，批號20181203）、Bcl-2相關X蛋白（Bax，貨號sc-20067，批號20190102）、半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase-3，貨號sc-56053，批號20190201）一抗購于美國Santa Cruz公司；鈣蛋白酶［Calpain，貨號EY-（K）-1003，批號12582012］一抗購自上海一研；HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG購于美國Thermo公司。

1.3 儀器Sysmex-chemix-180 型全自動生化分析儀購自日本Furuno Electric 公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；SG-51 正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR 公司；LD-66 實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

2 方法

2.1 造模及藥物干預將60 只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為：對照組、模型組、低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組，每組各15 只；除對照組外各組大鼠制成實驗性OJ大鼠模型；造模具體方法參考韓德蘭等［6］研究。完成造模后12 h，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組使用對應濃度茵陳五苓散灌胃。茵陳五苓散組成：茵陳30 g、茯苓片15 g、豬苓15 g、白術15 g、桂枝10 g水煎；低劑量茵陳五苓散組灌胃劑量為10 g·kg-1·d-1；高劑量茵陳五苓散組灌胃劑量為20 g·kg-1·d-1；對照組和模型組使用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)15 d。

2.2 檢測項目

2.2.1一般情況的觀察 藥物干預完成后立即稱大鼠體質量，處死并檢測肝臟相關質量計算肝指數(shù)。肝指數(shù)＝肝臟濕質量/體質量×100%。

2.2.2大鼠肝功能指標檢測 各組大鼠眼球取血，按照檢測試劑盒說明書方法檢測各組大鼠丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清總膽紅素（TBIL）和內毒素（ET）水平。

2.2.3大鼠氧化應激指標監(jiān)測 取大鼠肝組織，剪碎并使用胰蛋白酶制成勻漿，試劑盒說明書操作，檢測定大鼠肝組織中SOD、MDA含量水平。

2.2.4蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平 使用蛋白質印跡法檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3 和鈣蛋白酶表達水平。取大鼠肝臟組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白并轉移到PVDF 膜上加入置脫脂奶粉室溫封閉，并加入稀釋后的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白抗體，稀釋比例1：500，內參蛋白實驗β-actin，稀釋比例為1∶1 000，分析比較各目的蛋白與內參蛋白條灰度，計算各蛋白相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學方法本研究數(shù)據分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPad Prism 5，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；若P＜0.05則表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠體質量及肝指數(shù)檢測結果由表1 可以看出，相比對照組，模型組大鼠體質量、肝指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠體質量、肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。

表1 大鼠60只體質量及肝指數(shù)檢測結果/±s

表1 大鼠60只體質量及肝指數(shù)檢測結果/±s

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15體質量/g 385.22±38.21 485.78±55.54a 420.11±49.21b 398.79±39.99bc肝指數(shù)2.04±0.12 3.21±0.14a 2.53±0.17b 2.11±0.13bc

3.2 大鼠肝臟指標檢測結果相比空白對照組，模型組大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均顯著升高（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見表2。

3.3 大鼠肝臟內氧化物質檢測結果相比空白對照組，模型組大鼠MDA 含量水平顯著升高（P＜0.01），SOD 水平顯著降低（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠MDA 含量水平顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01），SOD 水平顯著升高且高劑量茵陳五苓散組顯著高于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見表3。

表2 大鼠60只肝臟指標檢測結果/±s

表2 大鼠60只肝臟指標檢測結果/±s

注：ALT 為丙氨酸氨基轉移酶，AST 為天冬氨酸氨基轉移酶，TBIL 為血清總膽紅素，ET 為內毒素。與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 ALT（U/L）72.30±7.21 212.02±30.00a 130.50±12.05b 93.15±10.25bc AST（U/L）42.30±8.20 200.15±42.40a 125.55±20.95b 83.47±12.27bc TBIL（μmol/L）9.31±1.30 188.58±20.10a 100.10±10.38b 72.30±10.25bc ET（EU/mL）0.33±0.03 0.77±0.03a 0.52±0.03b 0.40±0.03bc

表3 大鼠肝臟內氧化物質檢測結果/（U/mg，±s）

表3 大鼠肝臟內氧化物質檢測結果/（U/mg，±s）

注：MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶。與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 MDA 8.31±2.10 19.00±4.20a 13.50±3.21b 9.26±2.20bc SOD 310.54±44.05 220.78±45.65a 200.47±27.15b 270.15±32.06bc

3.4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測結果相比空白對照組，模型組大鼠Bax 蛋白表達水平和Caspase-3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠Bax 蛋白表達水平和Caspase-3 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高且高劑量茵陳五苓散組顯著高于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見圖1和表4。

表4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測結果/±s

表4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測結果/±s

注：Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2蛋白，Bax為Bcl-2相關X蛋白，Caspase-3 為半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶，β-actin 為β-肌動蛋白。與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 Bcl-2/β-actin值1.45±0.21 0.45±0.10a 0.69±0.23b 0.75±0.10bc Bax/β-actin值0.25±0.09 1.39±0.21a 1.00±0.15b 0.90±0.11bc Caspase-3/β-actin值0.45±0.12 1.60±0.30a 1.20±0.20b 1.00±0.19bc

3.5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達水平檢測結果相比空白對照組，模型組大鼠鈣蛋白酶蛋白表達水平顯著升高P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠肝組織鈣蛋白酶蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見圖2和表5。

表5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達水平檢測結果/±s

表5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達水平檢測結果/±s

注：Calpain 為鈣蛋白酶，β-actin 為β-肌動蛋白。與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 Calpain/β-actin值1.00±0.20 1.80±0.25a 0.75±0.15b 0.45±0.10bc

4 討論

肝臟損傷重要指標包括：血清ALT、AST 活力等。黃新造等［7］研究表明：血清 ALT、AST 活力可以一定程度上反映肝臟受損程度。本研究中可以看出，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組組大鼠ALT、AST 水平均顯著降低說明了茵陳五苓散可以有效降低肝細胞的受損程度。這可能是因為茵陳五苓散以茵陳為君藥，配合澤瀉、豬苓具有清熱解毒利濕、健脾化濁之功，同時茵陳是利膽退黃的主藥，可以減輕肝細胞壞死的程度，促進膽汁分泌降低血清中的ALT 及AST 水平。楊建橋、嚴清和［8］研究表明：茵陳五苓散可以降低ALT 及AST 水平，保護小鼠肝組織，本研究得出的結論與其相類似。

發(fā)生OJ 會使得腸粘膜屏障受到損害，使得大量的ET 會進入血液，進一步加重黏膜屏障的受損程度，并形成惡性循環(huán)［9］。TBIL是由體內紅細胞裂解而釋放出的血紅蛋白產生的，主要包括間接膽紅素和直接膽紅素［10］。耿焱等［11］研究表明：檢查TBIL 含量水平不僅能反映肝臟損害的程度，尤其對黃疸的鑒別具有重要意義，膽汁淤積會引起黃疸，TBIL 含量水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠TBIL 和ET水平均顯著降低說明了茵陳五苓散可以有效保護腸粘膜屏障。同時茵陳五苓散可以防止大量的膽酸及膽紅素淤積導致肝臟濕熱毒邪蘊積，影響血氣運行，從而造成肝細胞受損。王縛鯤等［12］研究表明：TBIL 是預測減黃效果的最佳指標，降低其含量可有效緩解OJ，本研究得出的結論與其相類似。

隨著醫(yī)療的進步，對活性氧的研究越來越深入，研究發(fā)現(xiàn)若發(fā)生氧化應激反映會使得MDA的水平升高，同時自由基清除劑如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等會嚴重減少或缺乏，同時還會影響細胞膜的通透性細胞內的SOD、GSH-Px 等酶釋放至細胞外［13］。MDA 也是反應體內脂質氧化的重要指標［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠MDA含量水平顯著降低，SOD水平顯著升高，說明大鼠體內的脂質氧化受到了顯著的抑制，同時氧自由基也顯著減少，這可能是因為茵陳五苓散中包含的茯苓片、白術等中藥具有抗氧化、清除自由基的效果。胡明華等［15］研究表明：降低自由基的含量水平可以有效保護OJ病人肝臟，本研究得出的結論與其相類似。

OJ 會損傷肝細胞，使得肝臟纖維化并促進肝細胞的程序性死亡，細胞的凋亡受到基因的調控，其中Caspase 家族是細胞凋亡的核心。Caspase 家族中Caspase-3 和Caspase-9 是重要的凋亡基因，可以啟動細胞的凋亡程序［16］。除了Caspase 家族蛋白可以調控細胞的凋亡，Bcl-2 家族蛋白也可以調控細胞的凋亡，在Bcl-2 家族中主要由Bcl-2 蛋白和Bax 蛋白分別抑制和促進細胞的凋亡［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠Bax 蛋白表達水平和Caspase-3 蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高，說明使用茵陳五苓散處理后可以顯著降低大鼠肝臟細胞的凋亡，有效保護發(fā)生OJ 后的肝細胞。

鈣蛋白酶是一種降解蛋白的酶，會降解肌原纖維中的蛋白，在OJ 病人肝組織內其表達會顯著增加，且與肝臟受損程度正相關［21］。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠肝組織鈣蛋白酶蛋白表達水平顯著降低，說明大鼠肝臟損傷得到了有效的緩解，這些可能和降低肝臟炎性細胞浸潤及成纖維細胞的增生有關。崔玉寶［21］研究表明：使用茵陳五苓散可以降低肝臟組織內的鈣蛋白酶基因及蛋白的表達并促進肝臟功能恢復。

綜上所述，茵陳五苓散可以有效保護實驗性OJ大鼠肝臟，其作用機制與抑制氧化應激、鈣蛋白酶的表達及肝細胞的凋亡相關。但本研究使用的劑量梯度較少，在后續(xù)的研究中將進一步探討茵陳五苓散的劑量對實驗性OJ大鼠肝臟保護的效果。

（本文圖1，2見插圖10-2）