鄒姒妮，馬戰(zhàn)英，李 楨，陳劍雄，方沛安(東莞市婦幼保健院PICU，廣東 東莞 523000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染已被證實(shí)與小兒消化性潰瘍、十二指腸潰瘍和慢性胃炎等疾病存在關(guān)聯(lián)[1]。Hp感染在全球患病率均較高，將Hp清除，能促進(jìn)潰瘍愈合，使胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低[2]。抗菌藥物是治療Hp感染的常用藥物，但不合理應(yīng)用抗菌藥物，容易引起耐藥性，導(dǎo)致療效欠佳[3]。目前，臨床針對(duì)Hp感染大多采用標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法，具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，有研究結(jié)果指出，抗菌藥物耐藥可能與Hp遺傳基因突變存在關(guān)聯(lián)[4]。本研究旨在分析東莞市婦幼保健院(以下簡(jiǎn)稱“我院”)89例小兒Hp感染患者的耐藥基因的突變情況，為Hp感染的治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

選取2017年1月至2019年6月我院收治的Hp感染患兒89例，對(duì)患兒臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)消化學(xué)組[5]制定的《兒童幽門螺桿菌感染診治專家共識(shí)》中關(guān)于小兒Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查等證實(shí)；(2)年齡≤14歲；(3)伴有明顯的消化不良癥狀，包括惡心、嘔吐、腹脹及反酸等；(4)病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)活動(dòng)性出血者；(2)既往Hp清除治療史者；(3)近4周內(nèi)抗菌藥物、質(zhì)子泵抑制劑應(yīng)用史者；(4)肝、腎、肺及心等臟器損害；(5)惡性腫瘤者；(6)過(guò)敏體質(zhì)者。其中男性46例，女性43例；年齡3～12歲，平均(8.75±2.14)歲；臨床癥狀：腹脹19例，腹痛33例，嘔吐15例，惡心11例，嘔吐10例，納差24例，反酸12例，燒心17例，便血4例。本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

所有患兒均接受以質(zhì)子泵抑制劑為中心的三聯(lián)方案，即奧美拉唑鈉腸溶片(規(guī)格:10 mg)，0.8～1.0 mg/d，1日分2次服用。阿莫西林克拉維酸鉀干混懸劑(7∶1)(規(guī)格:0.228 5 g/袋，每袋含阿莫西林200 mg和克拉維酸28.5 mg)，2～7歲患兒，1次1袋，每12 h給藥1次；7～12歲患兒，1次1袋半，每12 h給藥1次?？死顾仡w粒(規(guī)格：按C38H69NO13計(jì)0.125 g)口服，體重8～11 kg，1次62.5 mg，每12 h給藥1次；體重12～19 kg，1次0.125 g，每12 h給藥1次；體重20～29 kg，1次0.187 5 g，每12 h給藥1次；體重30～40 kg，1次0.250 g，每12 h給藥1次，療程為2周。

1.3 檢測(cè)方法

經(jīng)PCR擴(kuò)增試劑測(cè)定Hp分離菌株對(duì)克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥情況。主要試劑為PCR擴(kuò)增試劑(研拓生物)、瓊脂糖(研拓生物)及TAE電泳液(研拓生物)。(1)Hp菌株培養(yǎng)：取酵母粉劑5 g、氯化鈉5 g、蛋白胨粉劑5 g及瓊脂粉15 g，置于蒸餾水900 ml內(nèi)，充分混合，在高壓蒸汽環(huán)境下滅菌15 min。當(dāng)溫度下調(diào)至50 ℃后，取50 ml無(wú)菌胎牛血清加入，充分混合，將pH調(diào)整為7.5左右，定容至1 000 ml，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，各皿均取15～20 ml倒入，在37 ℃環(huán)境下反應(yīng)3～5 d，當(dāng)有較大菌落形成，則對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取。(2)提取Hp基因組DNA：①首次使用試劑時(shí)，根據(jù)試劑瓶所要求體積取無(wú)水乙醇加入Buffer W2內(nèi)，充分混勻；②取異丙醇125 ml，異丁醇75 ml，Buffer DV-A 2 ml，加入試劑瓶?jī)?nèi)，充分混勻；③將Buffer DV置于4 ℃冰箱內(nèi)備用；④準(zhǔn)備水浴，溫度為65 ℃；⑤針對(duì)Buffer G-B、Buffer G-A進(jìn)行水浴，使其變成透明色；⑥針對(duì)Eluent進(jìn)行加熱，使其達(dá)65 ℃。(3)提取Hp菌體基因組DNA：①取培養(yǎng)于平板上菌落，置于離心管(1.5 ml)內(nèi)；②取RNaseA 0.9 μl、Buffer G-A 650 μl，置于離心管內(nèi)，使菌體懸浮，在室溫(25 ℃)環(huán)境下反應(yīng)2 min；③離心1 min(12 000 r/min)，分離上清液，置于離心管(2 ml)內(nèi)；④取Buffer DV 1 ml、Buffer G-B 400 μl，在4 ℃環(huán)境下預(yù)冷，充分混合，離心5 min(12 000 r/min)；⑤棄上相，將下相、相間沉淀保留，取Buffer DV 1 ml加入，離心2 min(12 000 r/min)；⑥棄上相，將下相移至濾器，離心1 min(12 000 r/min)；⑦將去濾器棄除，取Buffer BV 400 μl加至濾液內(nèi)，充分混合；⑧取DNA制備管，放置在離心管(2 ml)內(nèi)，按照上述步驟轉(zhuǎn)移到制備管內(nèi)，離心1 min(12 000 r/min),將濾液棄除，取制備管放置在離心管(2 ml)內(nèi)，取Buffer W1 500 μl加入，離心1 min(12 000 r/min)；⑨將濾液去除，取制備管置于離心管(2 ml)內(nèi)，取Buffer W2 700 μl加入，離心1 min(12 000 r/min)，然后經(jīng)Buffer W2 700 μl進(jìn)行再次洗滌;將濾液棄除，離心1 min(12 000 r/min)，取DNA制備管置于離心管(1.5 ml)內(nèi)，取Eluent 100 μl，置于silica膜中間處，在室溫環(huán)境下反應(yīng)10 min，離心1 min(12 000 r/min)，對(duì)DNA進(jìn)行洗脫，存放于4 ℃冰箱內(nèi)待測(cè)。(4)測(cè)定DNA質(zhì)量：經(jīng)紫外吸收法檢測(cè)，分光光度計(jì)波長(zhǎng)分別為260、280 nm時(shí)，測(cè)定吸收值。(5)Hp相關(guān)耐藥基因檢測(cè)：克拉霉素耐藥基因?yàn)?3sRNA，阿莫西林克拉維酸鉀耐藥基因?yàn)镻BP1A，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，(94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán))，72 ℃、5 min，行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。

表1 引物設(shè)計(jì)表Tab 1 Primer design

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用率(%)表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp對(duì)克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥情況比較

共分離出Hp菌株89株，其對(duì)克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率分別為17.98%、15.73%，見(jiàn)表2。

表2 克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥情況比較Tab 2 Comparison of drug resistance to clarithromycin and Amoxicillin clavulanate potassium

2.2 不同性別患兒的耐藥情況分析

男性、女性患兒的Hp對(duì)克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同性別患兒的耐藥情況比較[菌株數(shù)(%)]Tab 3 Comparison of drug resistance between children with different genders [number of bacteria (%)]

2.3 Hp相關(guān)基因突變情況分析

克拉霉素A2142G、A2143G及T2182C的突變率分別為26.97%、3.37%及47.19%，以T2182C的突變率最高；阿莫西林克拉維酸鉀C1667G、A1684G及A1777G的突變率分別為4.49%、2.25%及12.36%，以A1777G的突變率最高；耐藥患兒的A2142G、A2143G基因突變率分別為91.67%、100.00%，高于敏感患兒的8.33%、0，見(jiàn)表4。

表4 Hp相關(guān)基因突變情況分析Tab 4 Analysis on Hp-related gene mutation

3 討論

Hp感染在兒童中發(fā)病率較高。研究結(jié)果表明，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，年齡6～12歲的兒童Hp感染率為6%～11%，然而，在發(fā)展中國(guó)家，兒童Hp感染率高達(dá)50%[6]。當(dāng)兒童受到Hp感染后，通常無(wú)法自行清除，如果未能積極接受治療，則會(huì)加重胃黏膜損害程度，引起胃潰瘍、胃炎等疾病，嚴(yán)重情況下，甚至進(jìn)展成胃癌[7]。有調(diào)查結(jié)果表明，>80%的十二指腸潰瘍與>50%的胃潰瘍存在Hp感染，Hp被根除后潰瘍的復(fù)發(fā)率即降低，說(shuō)明Hp在潰瘍病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此，針對(duì)兒童Hp感染，必須盡早進(jìn)行Hp清除治療，預(yù)防不良事件發(fā)生。

本研究針對(duì)Hp感染患兒采用了標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)方案治療，包括克拉霉素、阿莫西林克拉維酸鉀及質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑腸溶片?？死顾氐目咕钚暂^強(qiáng)，且對(duì)酸的穩(wěn)定性良好，在胃內(nèi)能起到良好的抗菌功效[8]。有研究結(jié)果指出，Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率為16.00%～27.60%[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率為17.98%，在上述范圍之內(nèi)。阿莫西林克拉維酸鉀對(duì)Hp根除具有重要意義，有研究指出其耐藥率較低，原因可能在于Hp感染對(duì)其產(chǎn)生的耐藥與β-內(nèi)酰胺酶不存在關(guān)聯(lián)[10]。本研究結(jié)果提示，Hp對(duì)阿莫西林的耐藥率為15.73%，略低于其對(duì)克拉霉素的耐藥率。

本研究通過(guò)分析Hp對(duì)藥物的耐藥率與Hp感染患兒性別的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其耐藥率與性別無(wú)關(guān)。但有研究結(jié)果提示，女性患者中分離的Hp對(duì)克拉霉素的耐藥率高于男性[11]。本研究并未發(fā)現(xiàn)這點(diǎn)，這可能是因納入對(duì)象的年齡段不同所致，本研究?jī)H納入兒童Hp感染者，非成年患者。通過(guò)分析Hp相關(guān)基因突變情況，發(fā)現(xiàn)克拉霉素T2182C、阿莫西林克拉維酸鉀A1777G位點(diǎn)的突變率較高，其他位點(diǎn)的突變率相對(duì)較低。既往有研究結(jié)果認(rèn)為，T2182C位點(diǎn)突變與克拉霉素用藥劑量密切相關(guān)[12]，這為本研究提供了理論支持。本研究結(jié)果顯示，耐藥患兒的A2142G、A2143G基因突變率高于敏感患兒。這表明耐藥率會(huì)影響藥物在不同位點(diǎn)的基因突變率，因此，在未來(lái)的Hp感染治療中，臨床需充分考慮到這一因素，便于提出更具針對(duì)性的治療方案。

綜上所述，小兒Hp感染患者中分離出的Hp對(duì)克拉霉素與阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率非常接近，其中耐藥患兒的A2142G、A2143G基因突變率較敏感患兒更高，臨床要對(duì)此引起重視。此外，本研究也有不足，如僅選取89例樣本，樣本量較少，未來(lái)需擴(kuò)大樣本量對(duì)此予以探討。