楊云云，蔡 璐，王學(xué)彬，高麗紅，張凌鵬，張文靜，王 卓(上海長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 00433)

替考拉寧為糖肽類抗菌藥物，口服不吸收，一般采用靜脈滴注或肌內(nèi)注射給藥。血清蛋白結(jié)合率為90%～95%，組織穿透性好，可進入白細胞內(nèi)，不能進入紅細胞、腦脊液和脂肪[1]。按照目前的指南推薦，替考拉寧和萬古霉素是目前治療革蘭陽性菌感染的一線藥物，特別是對于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus， MRSA)感染的效果較好[2-6]。由于替考拉寧的有效血藥濃度與臨床療效密切相關(guān)，因此，合適的劑量有助于達到治療相關(guān)血藥濃度從而顯現(xiàn)替考拉寧的療效[7-8]。藥動學(xué)/藥效學(xué)(PK/PD)參數(shù)是抗菌藥物臨床合理應(yīng)用的重要依據(jù)，目前替考拉寧的藥品說明書不僅推薦了應(yīng)用劑量，同時推薦了血藥濃度，建議血藥濃度不應(yīng)<10 mg/L[9-12]。因此，建立測定替考拉寧血藥濃度的方法對于提高臨床合理用藥水平十分重要。替考拉寧主要由5個結(jié)構(gòu)類似的化合物TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4及TA2-5組成，其中TA2-2占總成分≥80%[13-14]。由于其組分復(fù)雜，建立快速、有效且準(zhǔn)確的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)相對困難，因此，主要通過測定TA2-2的濃度替代替考拉寧來建立快速有效的測定方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A Prominence型高效液相色譜儀(日本島津公司)；C18色譜柱(美國Waters公司)；XW-80 A型漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；移液槍(德國普蘭德公司)；UB-10型美國丹佛pH計(美國丹佛儀器公司)；Eppendorf型離心機(上海琪特分析儀器有限公司)；電子天平(10 mg～220 g)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器有限公司)；DL-180A型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品100 mg(中國藥品食品檢定研究院)；對羥基苯甲酸甲酯100 g(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙腈4 L(HPLC級)/瓶(TEDIA)；磷酸二氫鈉500 g(AR)/瓶(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；磷酸500 ml(AR)/瓶(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；人血漿(上海長海醫(yī)院Ⅰ期臨床實驗室提供，血清置于-80 ℃條件下保存)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；保護預(yù)柱(ACE)；流動相為0.02 mol/L的NaH2PO4·2H2O(H3PO4調(diào)pH至2.50)-乙腈(V∶V=74.5∶25.5)；內(nèi)標(biāo)物為對羥基苯甲酸甲酯；流速為1.0 ml/min；檢測波長為240 nm；進樣量為0.020 ml；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液：精密稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，置于10 ml容量瓶中，加純凈水溶解稀釋至刻度，搖勻，制成2 mg/ml的溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取對羥基苯甲酸甲酯5.0 mg，置于100 ml容量瓶中，加入乙腈溶液稀釋后至刻度并充分混勻，制成0.05 mg/ml的溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液50 μl，加入空白血漿950 μl，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/ml的樣品A；吸取A溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為50 μg/ml的樣品B；吸取B溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為25 μg/ml的樣品C；吸取C溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為12.5 μg/ml的樣品D；吸取D溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為6.25 μg/ml的樣品E；吸取E溶液500 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為3.125 μg/ml的樣品F[或稱定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)]。

2.2.4 質(zhì)控樣品配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液50 μl，加入空白血漿950 μl，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/ml的樣品A；吸取A溶液250 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為33.33 μg/ml的樣品H；吸取H溶液250 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為11.11 μg/ml的樣品M；吸取M溶液250 μl，加入空白血漿500 μl，配制成質(zhì)量濃度為3.70 μg/ml的樣品L。

2.3 血清樣品的預(yù)處理

準(zhǔn)確吸取空白血漿樣本400 μl，置于離心管內(nèi)，再向內(nèi)加入50 μl內(nèi)標(biāo)儲備液，加入乙腈600 μl，置于旋渦混合器混合1 min，放入離心機中以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。吸取100 μl上清液，置于樣品瓶中，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

在空白血清中，加入2 mg/ml的替考拉寧儲備液50 μl和0.05 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液20 μl，渦旋混勻，按照血樣處理方法制成血清樣品測定液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。替考拉寧與內(nèi)標(biāo)物分離度良好，理論塔板數(shù)、重復(fù)性及拖尾因子均符合規(guī)定。替考拉寧的各組分保留時間合適，見圖1。

圖1 空白血漿中加入替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)后的色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma adding with teicoplanin standard and internal standard substance

2.5 線性范圍評價

按照“2.2.3”項下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后進樣，以校正因子f(TA2-2峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積)和X(TA2-2濃度)作線性回歸分析，采用加權(quán)最小二乘法(X=1/C2)，獲得回歸方程。替考拉寧在3.125～100 μg/ml范圍內(nèi)與校正因子f呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.016 175 6X-0.002 938 76(r=99.96%，n=6)。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度評價

按照“2.2.4”項下方法制備質(zhì)控樣品，取“2.2.3”項下LLOQ和高、中及低(樣品H、M及L)4個濃度的質(zhì)控樣品各5份，每日檢測1次，共檢測3 d，結(jié)果見表1—2。相對誤差(RE)=實測值/真實值×100%。批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi);對于LLOQ，應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。

表1 批內(nèi)及批間準(zhǔn)確度Tab 1 Accuracy of intra-batch and inter-batch

表2 批內(nèi)及批間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)Tab 2 Relative standard deviation (RSD) of intra-batch and inter-batch

2.7 提取回收率結(jié)果

制備3個濃度H、M和L含血漿的質(zhì)控樣品各5份，按照上述血漿處理方法處理，同時制備3個濃度H、M和L不含血漿的質(zhì)控樣品各5份，按照“2.1”項下方法進樣，分別記錄TA2-2和內(nèi)標(biāo)的峰面積。提取回收率計算公式：(質(zhì)控樣品峰面積/不含血漿質(zhì)控樣品峰面積)×100%。低、中、高和內(nèi)標(biāo)的提取回收率分別為102.86%±7.51%、100.52%±5.97%、97.65%±4.70%及100.92%±4.32%，能夠滿足測定的需求。

2.8 TA2-2及內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性

采用低、高濃度質(zhì)控樣品，平行3份，在預(yù)處理后及在所評價的條件儲存后立即分析。由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與標(biāo)示濃度進行比較，每個濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)。將處理后的患者血清測定液置于-20 ℃保存，按照“2.1”項下高效液相色譜方法，于15 d取樣進行含量測定，RSD為1.27%。表明-20 ℃條件下血清樣品在15 d內(nèi)是穩(wěn)定的。

3 討論

3.1 流動相及比例的調(diào)節(jié)

本研究流動相采用乙腈-磷酸二氫鈉[15]，通過不斷調(diào)節(jié)流動相的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈所占比例增大時，出峰時間縮短，峰與峰之間的分離效果不佳；當(dāng)磷酸鹽所占比例增大時，也出現(xiàn)分離效果不佳的現(xiàn)象，并且有拖尾等問題出現(xiàn)。同時，將流動相pH范圍設(shè)定在2.0～4.0進行實驗，發(fā)現(xiàn)相對pH較高時，出峰提前；pH較低時，出峰延后，與文獻報道相符[14]。通過不斷調(diào)整pH、乙腈的比例，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaH2PO4濃度為0.2 mol/L、pH為2.50時，乙腈與NaH2PO4的體積比在74.5∶25.5時，替考拉寧的各個峰都分離良好，保留時間長短合適，有利于實際臨床樣本的檢測。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

本研究內(nèi)標(biāo)物的初始選擇為哌拉西林鈉，但是由于其穩(wěn)定性差，在室溫(25 ℃)條件下僅能維持6.5 h，-20 ℃條件下維持7 d，并且在后期的實驗中出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象，因此，后期研究的內(nèi)標(biāo)物調(diào)整為穩(wěn)定性較好的對羥基苯甲酸甲酯溶，在室溫條件下可維持2 d，-20 ℃條件下可維持30 d。由此可見，對羥基苯甲酸甲酯的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于哌拉西林鈉，同時能夠與目標(biāo)峰分離。

3.3 柱溫及流速的選擇

流速增加，出峰時間縮短，但是重現(xiàn)性較差；流速降低，重現(xiàn)性尚可，但是出峰時間延長。1 ml/min為本研究的最佳流速。柱溫對結(jié)果也有顯著的影響，柱溫升高，峰形會出現(xiàn)拖尾并且出峰時間延后。因此，在研究過程中需要保證流速和柱溫的穩(wěn)定。

綜上所述，在本研究色譜條件下，替考拉寧能夠在12 min內(nèi)出峰，并且內(nèi)標(biāo)很穩(wěn)定，與TA2-2分離度良好，能夠作為臨床的常規(guī)檢測方法。