趙明明，陳亞南，路 童，李國飛，肇麗梅(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110004)

米卡芬凈是由鞘莖點(diǎn)霉(Coleophoma empetri)酶解產(chǎn)物通過化學(xué)修飾合成的一種半合成脂肽類化合物，可非競爭性抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，從而破壞細(xì)胞壁的完整性，是繼卡泊芬凈后被批準(zhǔn)的第2種棘白菌素類抗真菌藥[1-2]。棘白菌素類藥物對(duì)于大多數(shù)常見的念珠菌屬顯示出殺菌活性，對(duì)于曲霉菌等易感霉菌顯示出抑菌作用[3-4]。由于米卡芬凈的作用靶標(biāo)1,3-β-D-葡聚糖合成酶是真菌的特異性酶，因此，其具有治療指數(shù)高、抗菌譜廣、不良反應(yīng)發(fā)生率低及藥物相互作用少的特點(diǎn)[5-6]。米卡芬凈主要用于治療食道念珠菌感染、骨髓移植及獲得性免疫缺陷綜合征患者中性粒細(xì)胞減少癥的預(yù)防[7]。重癥感染常伴有侵襲性真菌病，因此，米卡芬凈在重癥患者中應(yīng)用廣泛[8]。本研究旨在建立高效液相色譜紫外檢測法(high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，HPLC-UV)用于測定人血漿中米卡芬凈的濃度，并將其應(yīng)用于重癥患者體內(nèi)米卡芬凈血藥濃度的監(jiān)測，以期為重癥患者合理應(yīng)用米卡芬凈提供一定的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1100系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,配有Agilent1100紫外檢測器和Agilent 1200自動(dòng)進(jìn)樣器)；TARGIN VX-Ⅱ型多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)； TDL-40C型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)； Eppendorf 5424R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 中國有限公司)。

1.2 藥品與試劑

米卡芬凈標(biāo)準(zhǔn)品(含量>97.0%，批號(hào)為1-LXM-24-1，加拿大TRC)；氯唑沙宗(含量>98%，批號(hào)為100364-200301，中國藥品生物制品檢定所)，乙酸銨(含量≥99.0%，批號(hào)為BCBQ3068V，F(xiàn)luka試劑)；甲醇和乙腈均為色譜純，空白血漿由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輸血科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-5 mmol/L醋酸銨(V∶V=40∶60)；流速：1.0 ml/min; 柱溫：35 ℃；檢測波長：273 nm；進(jìn)樣量：50 μl。

2.2 溶液的配制

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取米卡芬凈10.03 mg, 置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.5、1、2.5、5、10、20和25 μg/ml的米卡芬凈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另外，精密稱取氯唑沙宗1.60 mg，置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容，配制成最終質(zhì)量濃度為16.0 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品處理方法

精密吸取血漿樣品100 μl于1.5 ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液(16.0 μg/ml氯唑沙宗溶液)50 μl，補(bǔ)加甲醇溶液100 μl，然后加入乙腈200 μl，渦旋混合5 min， 12 000 r/min條件下離心5 min，然后取上清液進(jìn)行HPLC分析。

2.4 方法學(xué)考察

在測試臨床樣本之前，按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”[9]對(duì)臨床生物樣品測定方法學(xué)確證的要求，進(jìn)行方法學(xué)考察，以驗(yàn)證方法。

2.4.1 專屬性考察：分別量取空白血漿及給藥后血漿樣品各100 μl，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理，獲得相應(yīng)色譜圖，見圖1。在本研究所建立的方法條件下，米卡芬凈、內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.421、3.928 min，兩者峰形良好，分離度能夠達(dá)到要求，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測定。

A.空白血漿；B.血漿樣品；1.內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗；2.米卡芬凈A. blank plasma; B. plasma sample; 1. chlorzoxazone for internal standard substance; 2. micafungin圖1 人血漿中米卡芬凈和內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗的典型色譜圖Fig 1 Typical chromatographic column of micafungin and internal standard substance in human plasma

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與定量下限：精密吸取空白血漿100 μl，加入“2.2”項(xiàng)下的米卡芬凈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.2、0.5、1、2.5、5、10、20及25 μg/ml的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理，然后進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，以米卡芬凈濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)，米卡芬凈與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：As/Ai=0.340 1C-0.000 069(r=0.999 8)?？梢娒卓ǚ覂粼跐舛葹?.2～25 μg/ml范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好，定量下限為0.2 μg/ml。

2.4.3 精密度與回收率：分別制備米卡芬凈低、中及高3個(gè)濃度(0.5、5和25 μg/ml)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每個(gè)濃度平行6份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品濃度，根據(jù)QC樣品測定結(jié)果計(jì)算方法的準(zhǔn)確度和精密度，見表1。同時(shí)，另取空白血漿100 μl，除不加內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)溶液外，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，向沉淀后的樣品中分別加入低、中及高3個(gè)濃度的QC樣品和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合后進(jìn)行HPLC分析，獲得相應(yīng)峰面積，以每個(gè)濃度2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表1。

表1 米卡芬凈的精密度與回收率Tab 1 Precision and recovery rate of micafungin

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取米卡芬凈低、中及高3個(gè)濃度(0.5、5和25 μg/ml)的QC樣品，每個(gè)濃度平行3份，分別考察4 ℃避光條件下放置8 h后提取、提取后4 ℃避光放置12 h、-70 ℃避光凍融循環(huán)3次和-70 ℃避光冰凍放置1個(gè)月的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，米卡芬凈的血漿樣品在上述條件下均有很好的穩(wěn)定性(RE%<±15%)。

2.5 臨床應(yīng)用

選取32例米卡芬凈治療重癥患者，在規(guī)律用藥3 d后，于下次給藥前采取靜脈血2 ml，以3 500 r/min離心10 min后取上層血漿，用所建立的方法測定米卡芬凈的濃度。32例重癥患者中，男性21例，女性11例，平均年齡(60.09±15.4)歲，平均體重(70.22±8.62) kg；根據(jù)患者病情的不同，給藥劑量分別為100、150及200 mg，1日1次;平均米卡芬凈血藥濃度為(12.09±6.43) μg/ml。

3 討論

重癥患者常常因感染性或非感染性因素引發(fā)病理學(xué)改變，導(dǎo)致出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征。引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征的一個(gè)重要結(jié)果，就是體液從損傷內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管漏過度滲透到組織間隙。這種情況在重癥膿毒癥和膿毒癥性休克患者中尤為明顯，這種組織間隙容積增大的情況可能導(dǎo)致藥物分布容積增加，從而導(dǎo)致血漿藥物濃度降低[10]。有研究結(jié)果表明，ICU的重癥患者體內(nèi)米卡芬凈的藥時(shí)曲線下面積(AUC0～24 h)顯著低于正常人及其他類型患者[11-12]。因此，建立一種有效的血藥濃度測定方法，并將其應(yīng)用于使用米卡芬凈進(jìn)行治療的臨床重癥患者，是十分有必要的。

米卡芬凈血藥濃度的測定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道。金錦等[13]報(bào)道了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定米卡芬凈的血藥濃度；曹江等[14]將高效液相色譜法熒光檢測用于其濃度的測定。但質(zhì)譜儀和熒光檢測器在醫(yī)療機(jī)構(gòu)并不常見，因此，開發(fā)一種HPLC-UV方法，更有利于監(jiān)測臨床重癥患者體內(nèi)的米卡芬凈血藥濃度。由于米卡芬凈不穩(wěn)定[15]，因此，使用過程中血樣的處理都在避光、冰浴情況下操作，以保證樣品測定的準(zhǔn)確性。

本研究建立了測定人血漿中米卡芬凈濃度的HPLC-UV方法，方法簡單、靈敏，專屬性強(qiáng)，具有普遍適用性，可將其應(yīng)用于臨床重癥患者體內(nèi)米卡芬凈血藥濃度的測定。