郝陽光， 陳薇， 章雪婷， 胡卜什

（1. 沈陽醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 遼寧 沈陽110034； 2. 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗與檢疫專業(yè)2017 級； 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2018級）

研究發(fā)現(xiàn)許多控制造血作用的信號通路在哺乳動物與果蠅之間是高度保守的， 如調(diào)控哺乳動物骨髓造血作用的Dpp／BMP、 Wnt、 JAK－STAT 及胰島素信號通路也影響果蠅淋巴腺造血干細(xì)胞的再生及分化， 因此果蠅造血系統(tǒng)已逐漸成為研究血細(xì)胞發(fā)育的遺傳模型［1］。 淋巴腺是果蠅幼蟲時期重要的造血器官， 由三個區(qū)域構(gòu)成： 成熟的漿細(xì)胞及晶細(xì)胞位于CZ 區(qū)（cortical zone）， 干細(xì)胞樣的前體血細(xì)胞位于MZ 區(qū)（medullary zone）， 而PSC 區(qū)（posterior signaling center） 作為造血干細(xì)胞小生境能夠維持MZ 區(qū)前體血細(xì)胞的正常分化［2－4］。

jumu基因是果蠅Fox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員， 我們前期研究發(fā)現(xiàn)該基因通過調(diào)控淋巴腺MZ 區(qū)Col的表達(dá)來維持前體血細(xì)胞的分化， 同時通過調(diào)控PSC 區(qū)dMyc的轉(zhuǎn)錄控制PSC 細(xì)胞的增殖［5］；jumu基因缺失可導(dǎo)致游離血細(xì)胞的增殖［6］。 此外， 近期研究表明jumu基因通過調(diào)控細(xì)胞的增殖及凋亡影響果蠅翅原基的發(fā)育［7］。 本研究探討了jumu基因缺失對果蠅淋巴腺血細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為深入理解該基因在果蠅淋巴腺中的作用及調(diào)控機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型果蠅w1118（為本實驗對照組）、jumu缺失突變體jumuGE27806及jumuDf2.12、 淋巴腺MZ 區(qū)特異性表達(dá)Gal4 品系domeless－Gal4UAS－2xEGFP均為東北林業(yè)大學(xué)金麗華教授惠贈； rabbit anti－PH3 antibody （德國Millipore 公司）； rabbit anti－GFP antibody、 Alexa Fluor 488 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）、 4′， 6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）、 7－氨基放線菌素D （7－AAD）、 Alexa Fluor 488 熒光二抗（美國Thermo Fisher Scientifific公司）； mouse anti－BrdU antibody （美國Developmental Studies Hybridoma Bank 公司）； In Situ Cell Death Detection Kit （美國Roche Biochemicals 公司）； 果蠅培養(yǎng)基由本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 PH3 及GFP 免疫熒光染色 提取果蠅三齡幼蟲淋巴腺或血細(xì)胞置于載玻片上， 血細(xì)胞需靜止30 min， 3.7%甲醛固定15 min， 5%羊血清封閉30 min， 加入PH3 抗體或GFP 抗體（1 ∶100） 并置于4 ℃冰箱孵育過夜， 加入Alexa Fluor 488 熒光二抗（1 ∶200） 結(jié)合2 h， DAPI （1 ∶500） 結(jié)合10 min， 封片劑封片并在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 BrdU 標(biāo)記 提取果蠅三齡幼蟲淋巴腺并置于含有160 μg／ml BrdU 的Schneider 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育1 h， 3.7%甲醛固定30 min， 酸解（3 mol／L HCl） 30 min 后結(jié)合BrdU 抗體， 后面方法同1.2.1。

1.2.3 phalloidin 染色 將提取的淋巴腺置于3.7%甲醛固定10 min， 0.1% TritonX－100 透化5 min， Alexa Fluor 488 標(biāo) 記 的phalloidin 結(jié) 合30 min， 封片油封片并置于顯微鏡下觀察。

1.2.4 TUNEL 及7－AAD 染色 TUNEL 染色參考In Situ Cell Death Detection Kit （Roche）， 淋巴腺先用3.7%甲醛固定30 min， 100 mmol／L 枸櫞酸鈉（sodium citrate） ＋0.1%PBT （PBS＋0.1% TritonX－100） 冰上孵育3 min， TUNEL 混合液37 ℃孵育75 min。 7－AAD 染色： 提取的淋巴腺直接置于7－AAD （5 μg／ml） 中染色30 min， DAPI （1 ∶500） 結(jié)合10 min。

1.2.5 圖像分析及定量 所有定量圖像均用熒光顯微鏡進(jìn)行采集， 并用ImageJ 軟件進(jìn)行分析， 每組采集的淋巴腺均不少于20 個， 細(xì)胞數(shù)不少于500 個， 并均進(jìn)行3 次以上生物學(xué)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析， 組間差異采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1jumu基因缺失對果蠅淋巴腺增殖的影響 通過PH3 抗體染色檢測淋巴腺處于有絲分裂M 期的血細(xì)胞， 該結(jié)果顯示， 與野生型對照組w1118相比，jumu基因缺失雜合子jumuGE27806／＋與jumuDf2.12／＋及jumu雙突變體jumuGE27806／jumuDf2.12淋巴腺中PH3＋血細(xì)胞數(shù)量明顯增加， 見圖1A－E； 通過BrdU 抗體染色檢測淋巴腺處于有絲分裂S 期的細(xì)胞， 結(jié)果顯示， 與對照組相比，jumu基因缺失雜合子淋巴腺中BrdU＋血細(xì)胞數(shù)量沒有明顯增加， 但jumu雙突變體的BrdU＋血細(xì)胞數(shù)量顯著增加， 見圖1F－I。

圖1 jumu 基因缺失對果蠅淋巴腺血細(xì)胞增殖的影響

2.2jumu基因缺失對淋巴腺血細(xì)胞發(fā)育及細(xì)胞黏附性的影響 phalloidin 用于標(biāo)記淋巴腺的F－actin細(xì)胞骨架， 結(jié)果顯示， 與對照組w1118淋巴腺血細(xì)胞相比，jumu基因缺失突變體淋巴腺血細(xì)胞明顯增大，jumu基因雙突變體jumuGE27806／jumuDf2.12淋巴腺中部分血細(xì)胞的直徑約為對照組的2 倍， 且細(xì)胞排列不規(guī)則， 細(xì)胞間連接不緊密且淋巴腺邊緣出現(xiàn)不規(guī)則缺口， 見圖2A－C。dome＞GFP主要表達(dá)在淋巴腺MZ 區(qū)， 標(biāo)記前體血細(xì)胞， 但在游離血細(xì)胞中不表達(dá)。 通過檢測游離血細(xì)胞中dome＞GFP＋陽性細(xì)胞的數(shù)量來判斷淋巴腺解離情況， 結(jié)果顯示， 與對照組相比，jumuDf2.12／＋游離血細(xì)胞中dome＞GFP＋陽性的前體血細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的22%，約為對照組的5 倍， 見圖2D－F。

圖2 jumu 基因缺失對淋巴腺血細(xì)胞發(fā)育及細(xì)胞黏附性的影響

2.3jumu基因缺失對淋巴腺血細(xì)胞凋亡的影響采用TUNEL 染色方法分析淋巴腺血細(xì)胞凋亡， 結(jié)果顯示， 與對照組相比，jumu基因缺失突變體淋巴腺血細(xì)胞并未出現(xiàn)明顯凋亡； 7－AAD 染色用于標(biāo)記死亡的細(xì)胞， 結(jié)果顯示， 與對照組相比，jumu基因缺失突變體淋巴腺中死亡的血細(xì)胞數(shù)量并未明顯增加， 見圖3。

圖3 jumu 基因缺失對淋巴腺血細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

造血作用是一個比較復(fù)雜的生物學(xué)過程， 包括造血干細(xì)胞的靜息及分化， 該穩(wěn)態(tài)遭到破壞會導(dǎo)致血液腫瘤的發(fā)生， 如白血病等。 淋巴腺作為果蠅重要的造血器官［8］， 已逐漸用于造血干細(xì)胞維持及分化機(jī)制的研究。 近來研究表明， 一些引起白血病發(fā)生的信號通路， 如JAK－STAT 的激活可誘導(dǎo)果蠅出現(xiàn)類似白血病的表型， 如淋巴腺的過度增長及血細(xì)胞數(shù)量的增加及黑色素瘤的產(chǎn)生等［9］。 可引起慢性粒細(xì)胞白血病（CML）、 急性髓細(xì)胞或淋巴性白血 （AML／ALL） 的BCR－ABL、Tax－1、 RUNX1 及NUP98－HOXA9 （NA9） 融合蛋白也能導(dǎo)致果蠅淋巴腺出現(xiàn)類似白血病的性狀［1，10］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)Jumu 分別在淋巴腺的MZ及PSC 區(qū)調(diào)控前體血細(xì)胞的分化， 同時發(fā)現(xiàn)jumu基因嚴(yán)重缺失可導(dǎo)致淋巴腺lobe2 異常增大， 但并未進(jìn)一步分析Jumu 對整個淋巴腺增殖的影響。 本研究發(fā)現(xiàn)Jumu 通過調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期來維持淋巴腺血細(xì)胞的正常增殖，jumu基因的缺失可加速細(xì)胞周期進(jìn)程， M 期及S 期的血細(xì)胞數(shù)明顯增加最終導(dǎo)致淋巴腺的增殖。 此前的研究中發(fā)現(xiàn)jumu基因的嚴(yán)重缺失僅導(dǎo)致淋巴腺lobe2 的增大，但部分lobe1 要比對照組要小。 本研究發(fā)現(xiàn)jumu基因的缺失可導(dǎo)致淋巴腺血細(xì)胞的過早解離， 可能是導(dǎo)致淋巴腺lobe1 變小的主要原因。 正常情況下淋巴腺只有到了成蛹階段才開始發(fā)生解離并釋放血細(xì)胞到血淋巴中［11］。 此外， 當(dāng)宿主受到感染時也會引起淋巴腺血細(xì)胞的增殖、 薄層血細(xì)胞分化及血細(xì)胞的釋放［8，12］。 前期的研究結(jié)果表明jumu基因的缺失引起淋巴腺免疫信號的激活及薄層血細(xì)胞的產(chǎn)生［5］， 因此淋巴腺的過早解離可能是免疫信號激活導(dǎo)致的。 此外之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)jumu基因的缺失導(dǎo)致游離血細(xì)胞actin 細(xì)胞骨架的改變， 出現(xiàn)偽足缺失的表型［6］， 因此淋巴腺血細(xì)胞的過早解離也可能是由于細(xì)胞骨架的改變導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性減弱而引起的。 同時本研究發(fā)現(xiàn)， 與游離血細(xì)胞表型一致，jumu基因缺失突變體淋巴腺血細(xì)胞明顯增大。 盡管有研究表明jumu基因的缺失可引起翅原基凋亡及死亡細(xì)胞增加［7］， 但本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)淋巴腺血細(xì)胞的凋亡， 表明Jumu 通過不同的調(diào)控機(jī)制參與不同的組織器官的發(fā)育。

綜述所述， Jumu 通過調(diào)控細(xì)胞周期影響淋巴腺血細(xì)胞的增殖， 但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。