曾潔，鄧志慧，付紅娟，劉暢，古儀，鄒奕昕，常徽

茶黃素激活Nrf2/HO-1通路保護血管內皮細胞氧化應激損傷

曾潔，鄧志慧，付紅娟，劉暢，古儀，鄒奕昕，常徽*

西南大學食品科學學院，重慶 400715

為探討茶黃素（Theaflavin，TF）對過氧化氫（H2O2）誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷的保護效應及作用機制，將人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC分為對照組、損傷組（0.2?mmol·L-1H2O2處理）和TF預處理組（2.0、5.0、10.0?μmol·L-1TF和0.2?mmol·L-1H2O2處理）。損傷組和TF組均以H2O2處理24?h，其中TF組先以不同濃度TF預處理2?h，對照組均以定量溶劑處理。以MTT法測定細胞活力，DCFH-DA探針測定活性氧（ROS）水平，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot測定蛋白表達水平，相應試劑盒測定乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）活性。結果顯示，與對照組相比，損傷組細胞活力顯著降低，LDH釋放量增加，NO水平降低，胞內ROS水平升高，MDA增加，抗氧化酶活力降低，細胞凋亡升高；TF預處理能夠顯著提高細胞活力，降低LDH水平，維持NO水平，降低胞內ROS水平及MDA的產生，提高抗氧化酶活力，并抑制細胞凋亡；進一步研究顯示，TF能夠激活Nrf2/HO-1通路，且Nrf2抑制劑會顯著降低TF的內皮細胞保護效應?？梢姡琓F能夠有效抑制H2O2誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷，其機制至少部分是通過激活Nrf2/HO-1通路實現(xiàn)的。

茶黃素；血管內皮細胞；氧化應激損傷；保護機制；動脈粥樣硬化

隨著我國社會經濟的快速發(fā)展、人們生活方式的改變，以及人口老齡化和城鎮(zhèn)化進程的加快，心血管病相關危險因素的流行趨勢明顯，心血管病發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均持續(xù)增高，且在未來10年還會繼續(xù)升高。目前，我國心血管病患病人數(shù)約為2.9億，其中腦卒中1?300多萬，冠心病1?100多萬，心血管病死亡率居我國居民疾病總死亡原因的首位，占疾病死亡構成的40%以上[1-3]。同時，心血管病住院總費用也在快速增加，增長速度遠高于我國國民生產總值增速。心血管病的負擔日漸加重，已經成為我國重大的公共衛(wèi)生問題，有效防治心血管病刻不容緩。

飲食、營養(yǎng)與心血管病的發(fā)生發(fā)展密切相關，探討通過膳食途徑預防血管病變、腦卒中、心臟病等，具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，長期飲用紅茶能夠顯著降低血漿低密度脂蛋白（LDL）和總膽固醇水平，同時降低收縮壓，還可抑制體重增加，降低腰圍和腰臀比[4-5]。這表明，紅茶對于心血管病可能具有良好的預防作用。茶黃素（Theaflavin，TF）是紅茶中存在的一類重要的生物活性物質，對紅茶的湯色、滋味和品質起著決定性的作用，是紅茶具備生物學效應的物質基礎[6-7]。目前，已從紅茶中分離鑒定出20多種TF類化合物（TFs），這些TF衍生物與TF具有相似的結構和生物學活性，其中最主要的TFs有4種：TF、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（TFDG）[8-9]。研究顯示，TFs具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降脂等作用[10-14]，但其對血管內皮細胞損傷的保護效應研究尚少，且機制不清。本研究以H2O2誘導內皮細胞氧化應激損傷為試驗模型，觀察TF對內皮細胞損傷的保護效應，并探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC），購于上海蓋寧生物科技有限公司。TF（純度98%）購于南京草本源生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解–20℃避光分裝保存?zhèn)溆?。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司。DMSO、噻唑藍（MTT）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購于北京眾康志恒生物科技有限公司。RIPA細胞裂解液、BCA 蛋白含量測定試劑盒、一抗Nrf2、HO-1、-actin、二抗和DAB顯色試劑盒均購于上海碧云天生物技術研究所。EpiQuik核蛋白提取試劑盒購于艾美捷科技有限公司。Nrf2抑制劑ML385購于Selleck Chemicals公司。

1.2 材料與方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組

采用10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液和傳代。將細胞分為3組：對照組（NC）、損傷組（MC）和TF預處理組（P-TF）（2.0、5.0、10.0?μmol·L-1處理組）。P-TF先以2.0、5.0、10.0?μmol·L-1的TF處理細胞2?h，然后以PBS清洗2次，加入新鮮培養(yǎng)基，再以0.2?mmol·L-1的H2O2處理細胞24?h；MC以等量溶劑處理2?h，PBS清洗2次，再以H2O2處理細胞24?h；NC均以等量溶劑做相應處理。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力水平

取對數(shù)生長期的第2~4代細胞，調整細胞濃度，以1×104個·mL-1接種于96孔板，每組6個復孔，每孔100?μL。細胞按前述分組處理，處理完成前4?h，每孔加20?μL 5?mg·mL-1MTT，棄上清液，以PBS洗2次，每孔加入150?μL DMSO溶解結晶顆粒，搖床低速振蕩10?min（或37℃孵育15?min溶解結晶），在酶標儀490?nm處測定吸光度，設空白調零。

1.2.3 細胞上清液LDH和NO水平測定

將處于對數(shù)生長期的細胞接種于24孔板，按上述分組處理，然后分離細胞培養(yǎng)上清液，嚴格依照試劑盒說明書測定上清液中LDH活性水平和NO含量。

1.2.4 細胞內ROS測定

將細胞接種于6孔板，分組處理后棄上清液，用PBS洗滌細胞3次，然后加入10?μmol·L-1DCFH-DA，培養(yǎng)箱內孵育15?min；熒光顯微鏡下取相，使用多功能酶標儀在488?nm激發(fā)波長、525?nm發(fā)射波長下測定熒光強度。

1.2.5 細胞MDA水平及SOD、CAT和GSH-Px活性水平的測定

將細胞接種于6孔板，分組處理后消化、離心、棄上清液，加入500?μL PBS制成細胞懸浮液，超聲裂解，嚴格依照相應檢測試劑盒說明書測定。

1.2.6 細胞凋亡的測定

將細胞接種于6孔板，分組干預處理后，消化、離心、棄上清液，收集各組細胞，用500?μL結合緩沖液重懸細胞，而后分別加入10?μL Annexin V-FITC和10?μL PI染料，混勻后于室溫避光條件下反應15?min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

總凋亡細胞率=早期凋亡細胞率＋晚期凋亡細胞率。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達水平

收集細胞，利用RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，同時按照核蛋白提取試劑盒操作說明提取核蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度測定；根據(jù)蛋白濃度，以12%分離膠、5%濃縮膠SDS-PAGE電泳，上樣量為20?μL（含40?μg蛋白）。用半干性轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉（TBST配制）封閉2?h。一抗Nrf2、HO-1（1︰1?000），4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜3次后，各10?min，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1︰5?000），室溫振蕩孵育1?h，再以TBST振搖洗膜3次后，加入ECL化學發(fā)光液，采用VILBER FUSION FX7成像系統(tǒng)自動曝光。利用Quantity One軟件進行條帶分析。

1.2.8 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 TF對HUVEC細胞的細胞毒作用

以不同濃度的茶黃素（TF）處理HUVEC細胞24?h，觀察茶黃素對細胞活力的影響。如圖1所示，茶黃素在0~120?μmol·L-1濃度劑量內，與NC比較，對HUVEC細胞增殖活力無顯著影響，未見明顯細胞毒作用。

2.2 TF預處理對H2O2作用下HUVEC細胞活力及凋亡的影響

分別以2.0、5.0?μmol·L-1和10.0?μmol·L-1的TF預處理HUVEC細胞2?h，觀察其對H2O2（0.2?mmol·L-1）作用下HUVEC細胞活力及凋亡的影響。結果如圖2所示，H2O2處理細胞24?h，與空白對照組比較，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率明顯升高；TF預處理能夠顯著抑制H2O2誘導的細胞毒性，提高細胞活力，并抑制細胞凋亡，其保護作用呈劑量依賴性效應關系。

2.3 TF預處理對氧化應激條件下內皮細胞LDH和NO釋放水平的影響

分離細胞培養(yǎng)基上清液，檢測各組細胞LDH和NO釋放水平，結果如圖3所示，H2O2作用下細胞LDH的釋放水平顯著升高，而NO釋放水平明顯降低，表明內皮細胞結構受到損害，導致胞內LDH外泄量增加，同時內皮細胞功能受損，分泌NO的能力降低；TF預處理能夠有效抑制LDH水平的升高和NO水平的降低，表明TF可有效保護內皮細胞，減輕細胞損傷，維護內皮細胞結構和功能正常。

2.4 TF預處理對H2O2作用下內皮細胞ROS水平和MDA生成的影響

由圖4中ROS水平的檢測結果顯示，H2O2作用下內皮細胞ROS水平顯著升高，表明胞內氧化應激壓力增大；與此一致，細胞氧化應激產物脂質過氧化物MDA水平顯著升高；TF預處理能夠有效降低胞內ROS水平，且顯著抑制MDA的生成，這表明TF預處理可以有效減輕H2O2造成的內皮細胞氧化應激損傷。

圖1 不同濃度TF處理HUVEC細胞24?h對細胞活力的影響

圖2 TF預處理對H2O2作用下HUVEC細胞活力及凋亡的影響

圖3 TF預處理對H2O2作用下內皮細胞LDH和NO釋放水平的影響

圖4 TF預處理對H2O2作用下內皮細胞ROS水平和MDA生成的影響

2.5 TF預處理對氧化應激條件下內皮細胞抗氧化酶活性的影響

由圖5可見，對內皮細胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性水平的檢測結果顯示，H2O2作用下細胞內SOD、CAT和GSH-Px活性水平均出現(xiàn)不同程度下降，表明細胞氧化-還原調節(jié)系統(tǒng)明顯受損；TF預處理能夠有效增強SOD、CAT和GSH-Px活性水平，維持細胞氧化-還原調節(jié)平衡，提高內皮細胞應對氧化應激的能力。

2.6 Nrf2/HO-1信號通路在TF抑制內皮細胞氧化應激損傷中的作用

Nrf2信號通路在氧化應激反應中發(fā)揮重要作用，本研究采用Western blot方法檢測了Nrf2和HO-1的蛋白表達水平（圖6）。由圖6可見，H2O2作用后受損細胞Nrf2和HO-1的蛋白表達水平均顯著降低，TF能夠上調Nrf2的表達及核移位，激活Nrf2/HO-1信號通路。為了進一步驗證Nrf2信號通路在TF抑制內皮細胞氧化應激損傷中的作用，以Nrf2的抑制劑ML385干預試驗，觀察其對TF保護效應的影響?？梢?，ML385會顯著降低核內Nrf2的水平和HO-1表達水平，并減弱TF對氧化應激誘導細胞毒性和凋亡的抑制作用，說明TF至少部分是通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮內皮細胞保護作用的。

圖5 TF預處理對H2O2作用下內皮細胞抗氧化酶活性的影響

圖6 Nrf2信號通路在TF抑制內皮細胞氧化應激損傷中的作用

3 討論

TFs占紅茶固形物的0.3%~1.5%，是紅茶中一類重要的活性成分[15]。TFs是兒茶素類化合物（包括兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等）在多酚氧化酶的催化下，通過與空氣中氧氣進行氧化縮合而形成，是一類苯駢?酚酮類衍生物，通過C2-C4、C2-C6鍵與2個苯駢二氫吡喃環(huán)相連接，形成特定的分子結構和空間構象[6-9]。研究表明，TFs無論在體外還是在體內，均具有優(yōu)良的抗氧化、抑菌、抑癌等[10-14]生物學特性，作為一種天然的膳食活性成分，TFs在食品、醫(yī)藥保健等領域有著廣闊的應用前景。

動脈粥樣硬化是動脈內膜產生脂質等血液成分的沉積，同時血管平滑肌細胞增生和膠原纖維增多，形成血管壁硬化和粥糜樣含脂壞死病灶，這樣一系列血管病理變化的過程。血管內皮細胞是介于血流和血管壁組織之間的一層單核細胞，在動脈粥樣硬化的發(fā)生環(huán)節(jié)中，血管內皮細胞損傷以及由此產生的炎癥反應，扮演著關鍵角色，抑制內皮細胞損傷，維護內皮正常的結構和功能，對于抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生至關重要[16-19]。氧化應激損傷是血管內皮細胞常見的病理損傷，活性氧自由基、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、脂多糖、同型半胱氨酸、高血糖和高血脂等，均可誘導血管內皮細胞產生氧化應激，造成結構和功能損傷。氧化損傷會引起內皮細胞脂質過氧化物增多，細胞活力降低，細胞壞死和凋亡增加，引發(fā)血管內皮結構改變和功能障礙[20-21]。在本研究中，H2O2處理血管內皮細胞，會導致內皮細胞結構損傷，致使細胞外漏LDH水平顯著升高，同時細胞NO分泌水平下降，表明細胞的內皮功能顯著受損，而血管內皮損傷和功能障礙，是導致心血管發(fā)生的始動因素[22-23]。我們的研究顯示，TF能夠有效抑制H2O2對內皮細胞造成的氧化應激損傷，降低細胞ROS水平，減輕脂質過氧化物的產生，提高細胞活力，抑制細胞凋亡，增強細胞抗氧化酶系的活力，維護細胞內皮功能。這表明TF對于血管內皮細胞氧化應激損傷具有良好的保護效應，長期飲用紅茶攝入TFs，可能對于預防動脈粥樣硬化以及心血管病具有一定的積極作用。

值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)茶黃素和茶多酚同樣可以發(fā)揮促氧化作用。研究顯示，高濃度條件下（>50?μmol·L-1）茶黃素能夠顯著誘導牙齦成纖維細胞和舌癌細胞發(fā)生氧化應激，導致細胞內GSH耗盡，進而誘導細胞凋亡，茶黃素的促氧化作用在腫瘤細胞中更加明顯，因此對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用[24]。另外，研究顯示高濃度EGCG可對體外紅細胞發(fā)揮促氧化作用，降低膜蛋白巰基含量水平，并誘導膜蛋白聚集[25]?？梢姡椟S素發(fā)揮抗氧化或促氧化作用與其濃度、細胞類型、環(huán)境條件等密切相關。在本研究中TF濃度較低，對血管內皮細胞可發(fā)揮抗氧化保護作用，高濃度下或者對其他細胞會發(fā)揮何種作用尚需要進一步研究。

另外，綠茶和兒茶素生物學效應的研究廣受關注，紅茶和TFs由于成分復雜、含量較低等原因研究較少，近些年來隨著食品分析技術的發(fā)展，人們對TFs的研究逐漸增多。研究顯示，茶多酚能夠通過抗炎、調節(jié)血脂水平、抑制LDL氧化修飾、改善內皮功能等不同途徑抑制AS的發(fā)生發(fā)展[26-27]；Huang等[28]研究顯示，綠茶多酚EGCG能夠激活Akt/eNOS信號途徑，抑制高糖引起的內皮組織損傷，增強內皮細胞的NO分泌功能；另一項研究表明，綠茶多酚能夠調節(jié)血管內皮細胞生長因子的表達，從而對血管內皮細胞的增殖和存活產生顯著影響[29]；不僅如此，綠茶多酚能夠通過增強內皮細胞功能以降低血壓，從而對心血管病起到良好的預防作用[30]。紅茶和TFs對心血管病是否具有同樣的保護效應，它們與綠茶多酚存在怎樣的異同，這值得深入研究和對比。

本研究發(fā)現(xiàn)，TF能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路進而增強抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px發(fā)揮保護作用，Nrf2/HO-1信號通路在細胞應對氧化應激過程中至關重要，TF是如何激活此信號通路增強細胞抗氧化反應能力的，其作用機制值得探究。研究顯示，Nrf2受DNA甲基化調控，其基因啟動子區(qū)的甲基化水平直接影響其表達水平[31]；TF是否通過影響DNA甲基化調節(jié)Nrf2的表達，尚需要進一步的研究證實。

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Theaflavin Activates Nrf2/HO-1 Pathway to Alleviate Oxidative Stress Injury in Vascular Endothelial Cells

ZENG Jie, DENG Zhihui, FU Hongjuan, LIU Chang, GU Yi, ZOU Yixin1, CHANG Hui*

College of Food Science, Southwest University, Chongqing, 400715, China

To investigate the protective effect of theaflavin (TF) on injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by hydrogen peroxide (H2O2), HUVECs were divided into control group, injury group (0.2?mmol·L-1H2O2treatment) and TF pretreatment groups (2.0, 5.0, 10.0?μmol·L-1+0.2?mmol·L-1H2O2treatment). The TF pretreatment groups were pretreated with TF for 2?h. Then, both the injury group and the TF groups were treated with H2O2for 24?h, while the control group was treated with solvent. Cells activity was detected by the MTT method. The levels of lactic dehydrogenase (LDH), nitric oxide (NO), malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured by corresponding detection kits. Reactive oxygen species (ROS), cells apoptosis and protein expression levels were detected using DCFH-DA dying, flow cytometer and Western blot. The results show that cells activity was dramatically decreased in the injury group, and the levels of LDH, cellular ROS, MDA and cells apoptosis increased, while the level of NO and the activities of antioxidant enzymes were declined. TF pretreatment could increase cells’ viability, decrease the level of LDH, maintain the level of NO, and inhibit the increments of ROS and MDA, as well as cells apoptosis. Further study indicated that TF treatment could activate Nrf2/HO-1 signaling pathway, and the inhibitor of Nrf2 could reduce the protective effects of TF on HUVEC cells. In conclusion, TF could alleviate oxidative stress injury in vascular endothelial cells induced by H2O2. The mechanism is at least partly associated with the activation of Nrf2/HO-1 pathway.

theaflavin, vascular endothelial cell, oxidative stress injury, protection mechanism, atherosclerosis

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2020)05-632-09

2019-12-24

2020-06-08

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（XDJK2020D030）

曾潔，女，碩士研究生，主要從事植物化學物及其生物學活性的研究。*通信作者：changhui2017@swu.edu.cn