蘇靜靜，阮麗，王麗鴛，韋康，吳立赟，白培賢，成浩*

茶樹氮吸收效率的早期鑒定技術(shù)研究

蘇靜靜1,2，阮麗1，王麗鴛1，韋康1，吳立赟1，白培賢1,2，成浩1*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

氮是植物生長的重要營養(yǎng)元素，在茶樹栽培過程中常需施用大量氮肥，不僅消耗大量的資源，施用不當還會造成一系列環(huán)境問題。培育氮肥高效利用的茶樹品種是解決這一問題的重要途徑，而建立快速篩選高效株系的早期鑒定方法對于縮短育種茶樹育種年限具有重要意義。本研究分析龍井43（LJ43）和中茶108（ZC108）兩個茶樹品種在不同氮素水平下對氨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收與利用數(shù)據(jù)，通過與15N同位素標記技術(shù)的比對，驗證非損傷微測技術(shù)（NMT）和實時熒光定量（qRT-PCR）技術(shù)在早期鑒定茶樹株系氮素吸收利用能力方面的可行性與實用性，以期建立茶樹氮吸收效率的室內(nèi)早期鑒定技術(shù)。試驗結(jié)果表明，15N同位素標記技術(shù)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性分別為89.51%、99.26%，而NMT的穩(wěn)定性、可重復(fù)性分別為95.22%、96.76%；兩種方法測定結(jié)果均顯示茶樹具有明顯的喜銨特性；硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白基因和在兩個品種中均表現(xiàn)出誘導(dǎo)上調(diào)表達效應(yīng)，相比中茶108，龍井43中和具有更高的表達量，表明LJ43對外界氮源的響應(yīng)高于ZC108。綜上所述，認為NMT技術(shù)可在短時間內(nèi)處理并測得茶樹的瞬時吸收速率，且試驗材料損耗少，可以用于茶樹氮瞬時吸收速率的早期鑒定；和的表達量一定程度上反映了茶樹對硝態(tài)氮吸收的能力。本研究可為氮高效茶樹品種的早期鑒定技術(shù)建立提供依據(jù)。

茶樹；氮吸收速率；非損傷微測技術(shù)；15N同位素示蹤；實時熒光定量

氮素作為植物所需的重要營養(yǎng)元素之一，對植物的生長發(fā)育及其產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀均有顯著影響[1]。隨著經(jīng)濟水平的發(fā)展和茶產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，人們對于各類茶葉產(chǎn)品的需求量日益增多，但限于茶園種植面積已達飽和，增加單位面積產(chǎn)量是提高經(jīng)濟效益的有效途徑[2]。茶樹[(L.) O. Kuntze]是多年生葉用經(jīng)濟作物，在生產(chǎn)過程中對氮素的需求量較高。增施氮肥對茶樹生長和產(chǎn)量具有積極作用，但隨著氮肥施用量逐年增加，茶園氮素利用效率明顯下降。盲目地增施氮肥還會導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)降低，病蟲害風險增加，以及環(huán)境污染等一系列問題[3-5]。因此，如何提高茶樹氮吸收效率，減少無效施用，在保質(zhì)保量的前提下，降低環(huán)境成本，成為茶學(xué)科研工作者的重大挑戰(zhàn)[6]，而培育高氮效率的茶樹新品種是解決這些問題的最直接途徑。但茶樹作為多年生作物，育種年限長，因此，開發(fā)快速有效的氮吸收早期鑒定技術(shù)對于縮短育種年限具有重要意義。

不同植物之間廣泛存在氮吸收效率的差異，同一植物的不同品種間也均存在氮效率的差異[7]。目前，氮吸收效率差異的相關(guān)研究已經(jīng)在小麥[7-10]、玉米[11-13]、水稻[14-15]、橡膠[16]和煙草[17]等多種植物上廣泛開展。已有研究表明，茶樹不同品種之間也存在明顯的氮吸收效率的差異。劉圓[18]對茶園中10個主栽茶樹品種從吸收動力學(xué)角度進行研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型茶樹品種間NH4+-N吸收動力學(xué)參數(shù)存在明顯差異。王新超等[19]試驗證明不同品種茶樹之間氮吸收效率存在著明顯的差異，并對選育高氮素利用效率茶樹品種的指標進行了初步篩選。但總體而言，茶樹在氮吸收效率測定方面還未形成統(tǒng)一標準。

15N同位素示蹤技術(shù)因其無輻射、物理性質(zhì)穩(wěn)定且準確性較高等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中，包括改良品種、生物固氮、氮肥效率及作物營養(yǎng)代謝等[20-21]，是測定作物氮吸收效率較為常用的方法。近年來，對茶樹NH4+和NO3-吸收和利用的相關(guān)研究主要是利用15N同位素示蹤法[22-23]。但15N同位素示蹤技術(shù)試劑購買和樣品檢測價格昂貴，且制樣時需冷凍干燥以固定目標時間點樣品內(nèi)的同位素標記，因此僅可測定樣本某一特定時間點的氮素積累量。茶樹對氮素的吸收是一個動態(tài)過程，使用15N標記無法闡明NH4+和NO3-通量的動態(tài)過程[24]。近幾年，非損傷微測技術(shù)（NMT）因其具有對待測離子或分子進行實時、動態(tài)測定的特點，成為測定氮吸收的重要工具。NMT技術(shù)保證了生物樣品的完整性和生理活性，這對測定一些珍貴種質(zhì)資源的樣品具有重要意義，同時，該技術(shù)具有高分辨度和高靈敏度，保證了試驗的準確性[25-26]。隨著人們對茶樹氮代謝生理生化和分子機制的不斷研究，許多與茶樹氮代謝相關(guān)的基因被鑒定和克隆出來，但從分子生物學(xué)途徑篩選和評價茶樹品種吸收機制差異的研究較少[27]。因此可通過研究氮素吸收過程中相關(guān)基因的表達，在分子水平上為植物氮吸收高效品種早期篩選提供理論依據(jù)。實時熒光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）是指在PCR擴增過程中，利用熒光信號積累實現(xiàn)實時監(jiān)測，并通過外參或內(nèi)參基因?qū)Υ郎y樣品種的特定DNA序列進行定量分析的方法[28]。qRT-PCR與傳統(tǒng)PCR相比有諸多優(yōu)點，不僅實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，還具有特異性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、速度快等特點，成為分析生物學(xué)中基因表達的重要工具[29-30]。

龍井43（LJ43）作為廣泛種植茶樹品種，具有對氮肥響應(yīng)度高的特性，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，LJ43在缺氮、中氮和高氮處理下，兩年生盆栽苗每盆生物量分別為4.75、8.42、10.22?g，即施用氮肥就快速生長，不施氮肥則生長受抑制[31]。中茶108（ZC108）是LJ43通過人工輻照變異而來的品種，具有耐氮貧瘠的特性[32]。因此，本文選取LJ43和ZC108作為研究對象，通過與15N同位素標記技術(shù)的比對，驗證NMT和qRT-PCR技術(shù)在鑒別不同茶樹株系、品系和品種氮吸收效率高低和建立茶樹株系氮吸收能力早期鑒定技術(shù)方面的可行性和適用性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預(yù)處理

以LJ43、ZC108、白毫早（BHZ）、烏牛早（WNZ）、1712、1417、中茗6號（ZM6）、中茗7號（ZM7）、2807等品種（系）的一年生扦插苗為供試材料；挑選長勢一致的茶苗，轉(zhuǎn)移至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所溫室進行水培。

前期試驗結(jié)果表明[34]，茶苗在缺氮處理兩周后即達到氮饑餓狀態(tài)。根據(jù)本試驗茶苗的生長狀態(tài)，為增強氮饑餓效果，盡可能消除試驗材料原始狀態(tài)對試驗的影響，在樣品長出白色嫩根后進行了3周的氮饑餓預(yù)處理，即在上述完全營養(yǎng)液配方中去除氮元素，其他元素保持不變，進行通氧培養(yǎng)，營養(yǎng)液每周更換1次。

1.2 試驗儀器及試劑

試驗儀器：球型研磨機（TissueLyser Ⅱ，QIAGEN?），C/N元素分析儀（Thermo NE1112），同位素質(zhì)譜分析儀（Thermo finnigen Delta Plus AD），NMT營養(yǎng)研究工作站（NMT-NRP-00A00），LightCycler?480 Ⅱ。

主要試驗試劑：茶樹植物營養(yǎng)液定制干粉（Coolaber），15NH4NO3和NH415NO3（阿拉丁生物科技有限公司，上海），RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），F(xiàn)astQuant RT Kit試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。

1.3 15N同位素示蹤技術(shù)試驗

采用豐度為99%的15NH4NO3和NH415NO3，針對氨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別配置不同氮素濃度的氮標記培養(yǎng)基系列，結(jié)合楊亦揚[35]和王新超等[19]設(shè)置的試驗參數(shù)，本研究選取0.05、0.2、0.5、2、5?mmol·L-1等5個氮素濃度梯度作為試驗處理。培養(yǎng)基其他元素的配方同1.1章節(jié)。挑選長勢一致，進行過氮素饑餓處理的供試茶苗，轉(zhuǎn)移至含140?mL培養(yǎng)液的覆黑膜廣口瓶中培養(yǎng)。每瓶放置1株茶苗，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)24?h后[18]，將茶苗取出，用純凈水涮洗3次。每株地上部和地下部分開收集，冷凍干燥后稱重，并于球型研磨機（TissueLyser Ⅱ，QIAGEN?）中進行粉碎處理，待測。

15N樣品和大氣的千分差（δ15N）以及全氮含量（TN）測定使用C/N元素分析儀（Thermo NE1112），經(jīng)連續(xù)流接口裝置（Confio Ⅲ）與同位素質(zhì)譜分析儀（Thermo Finnigen Delta Plus AD）連接，用IAEA-N-1標準物質(zhì)對實驗室鋼瓶N2氣進行標定，氮同位素以大氣氮為參考標準。

1.4 NMT試驗

分別配置不同氮素濃度的測試液系列，各處理的氮素終濃度分別為0.05、0.2、0.5、2、5?mmol·L-1，測試液其他成分參照文獻[24]。挑選根系生長情況相近，氮饑餓處理后的供試茶苗，選擇新生嫩根，從距離根尖3~4?cm處迅速剪下，用濾紙條和玻璃塊將其固定在培養(yǎng)皿底部，置于測試液中平衡5?min，選擇根系成熟區(qū)距離根尖15~25?mm處（根表面光滑完整且沒有破損的點位）進行吸收速率的測定（圖1），采樣規(guī)格為X-30[24]。利用NMT營養(yǎng)研究工作站（NMT-NRP-00A00）的掃描離子選擇微電極技術(shù)測定NH4+和NO3-離子的近根表面端和遠根表面端兩點間的電壓差，利用校正得到的能斯特斜率和能斯特截距換算成兩點之間的離子濃度差，得出吸收/外排速率。每個處理測定7條根系，每條根系測試10?min。

1.5 qRT-PCR試驗

分別配置不同氮素濃度的氮培養(yǎng)基系列，各處理的氮素終濃度分別為0.05、0.2、0.5、2、5?mmol·L-1，培養(yǎng)液其他元素的配方同1.2章節(jié)。挑選長勢一致，進行過氮素饑餓處理的供試茶苗，轉(zhuǎn)移至含140?mL培養(yǎng)液的覆黑膜廣口瓶中培養(yǎng)，每瓶放置1株茶苗，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)24?h后，將茶苗取出，用純凈水涮洗3次。取茶樹根系于液氮中保存。

1.打好“人才牌”，提升支持力。要發(fā)展就必須打好“人才牌”，增強競爭力。要全力提升培訓(xùn)水平，在傳統(tǒng)培訓(xùn)方式之外，著力抓好“網(wǎng)絡(luò)課堂、班組課堂、現(xiàn)場課堂”這三個載體，合理配置資源，提高培訓(xùn)質(zhì)量和管理水平，努力開創(chuàng)“大培訓(xùn)”工作格局。加快現(xiàn)有人才隊伍建設(shè)。樹立“有能有為、人人是才”的人才理念和“培訓(xùn)就是企業(yè)最好的福利”的觀念，培育激勵機制，制定積極的激勵措施，大力創(chuàng)造有利于優(yōu)秀人才脫穎而出、施展抱負、發(fā)揮才干的環(huán)境，使每個人都能夠為企業(yè)發(fā)展建功立業(yè)。

取液氮保存的試驗材料，于研缽中加液氮迅速充分研磨至粉末狀，用于RNA提取。用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取茶樹根的RNA。之后使用FastQuant RT Kit（天根生化科技有限公司，北京）將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR試驗，所用引物見表1[34]?；虮磉_水平標準化的參考為GAPDH，以LJ43和ZC108的根部組織cDNA作為模板，采用LightCycler?480 Ⅱ進行qRT-PCR擴增。擴增程序為：94℃ 10?s；58℃ 5?s，72℃ 12?s，45個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。

圖1 非損傷微測技術(shù)測定LJ43根部NO3-流速的電鏡圖

表1 qRT-PCR熒光定量引物序列的信息

1.6 氮吸收效率計算公式及數(shù)據(jù)處理

根據(jù)15N在樣品中和大氣中的千分差（δ15N）計算樣品中15N原子豐度，如公式（1）[35]，再根據(jù)公式（2）計算出氮吸收效率，公式如下：

=（δN×0.366?3%）/100?0＋0.366?3%································（1）

=××總重/（根××15）································（2）

其中，表示樣品中15N的原子豐度0.366?3%為大氣標準15N原子豐度。（%）指樣品中全氮含量；總重（g）指樣品的總干重；根（g）指樣品中根的干重；（h）指吸收時間，表示氮吸收效率。

15N數(shù)據(jù)使用Origin 9進行數(shù)據(jù)分析，進行非線性米氏方程的擬合：=max×/（m＋），其中，離子吸收速率用（μmol·g-1·d-1）表示，最大吸收速率為max（μmol·g-1·d-1），（mmol·L-1）指底物氮濃度，該方程中max、m和（maxm）可用來定量描述根系對養(yǎng)分離子的吸收特性。max表示茶樹對氮離子吸收所能達到的最大吸收速率，max越大，則茶樹對氮離子吸收的內(nèi)在潛力越大；m為米氏常數(shù)；表征低濃度下離子的吸收親和性[36]。15N試驗技術(shù)方法學(xué)的評價指標如下：（1）可重復(fù)性是指在相同測量條件下，對同一被測量樣品進行連續(xù)多次測量所得結(jié)果之間的一致性。本研究通過測定每個樣品的3次技術(shù)重復(fù)獲得可重復(fù)性；（2）穩(wěn)定性是指測量儀器的計量特性隨時間不變化的能力，可以進行定量的表征。可通過測定2批不同時間段的樣品，評價其測量的穩(wěn)定性。

離子流測定數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進行標準化，去除異常值。使用Origin 9軟件進行數(shù)據(jù)分析。NMT技術(shù)的方法學(xué)評價指標定義如下：（1）本研究通過測定對1個位點測定3次所獲得的流速值獲得NMT技術(shù)的可重復(fù)性值；（2）通過測定3?min內(nèi)所有流速值的變異系數(shù)獲得NMT技術(shù)的穩(wěn)定性值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹根系對不同濃度氮素的吸收速率測定

采用15N同位素示蹤技術(shù)，測定了9個茶樹品種對NH4+和NO3-的吸收速率（圖2）。在0.05~5?mmol·L-1的氮素梯度下，所有品種對NH4+的吸收速率均大于NO3-。低濃度（0.05~0.5?mmol·L-1）時，ZC108和WNZ對NH4+的吸收速率較快，ZM7的吸收速率最慢。高氮（2~5?mmol·L-1）處理時，LJ43和ZM6對NH4+的吸收速率較快，ZM7和1417吸收速率較慢。低氮（0.05~0.5?mmol·L-1）處理時，2807和ZM7對NO3-的親和力較強；高濃度（2~5?mmol·L-1）時，1417對NO3-的吸收速率最低，ZM6對NO3-的吸收顯著優(yōu)于其他品種。各品種在低氮和高氮條件下的氮吸收能力排名是完全不同的。其中LJ43和ZC108對NH4+和NO3-的吸收速率與吸收動力學(xué)參數(shù)表如圖2所示。樣品對0.05~5?mmol·L-1梯度的氮素吸收，均表現(xiàn)出NH4+的吸收速率大于NO3-。低濃度（0.05~0.5?mmol·L-1）時，ZC108對NH4+吸收速率大于LJ43，且ZC108（3.535）的值高于LJ43（0.484），表明ZC108在低氮濃度培養(yǎng)液處理時對NH4+的親和力較強；高濃度（2~5mmol·L-1）時，LJ43對NH4+吸收速率大于ZC108，同時LJ43（308.722）的max高于ZC108（191.278），且氮素濃度為5?mmol·L-1時仍未達到飽和，表明LJ43在高氮濃度培養(yǎng)液處理時對NH4+的吸收潛力較大；LJ43和ZC108對NO3-的吸收規(guī)律相近，總體表現(xiàn)為LJ43優(yōu)于ZC108。LJ43（68.573）的max略高于ZC108（63.937），表明其在高氮濃度培養(yǎng)液下對NO3-的吸收潛力較大。兩品種的值幾乎沒有差異。

利用15N同位素示蹤的方法來測定植物對氮素的吸收與利用，在包括茶樹等諸多植物上已有廣泛的研究，方法相對成熟。因此，本研究僅隨機選取0.5?mmol·L-115NH4NO4處理下的LJ43作為樣本，進行了穩(wěn)定性以及可重復(fù)性分析（圖3）。15N同位素示蹤技術(shù)的可重復(fù)性達到99.28%，穩(wěn)定性為89.51%，均高于85%，表明本研究采用15N同位素示蹤技術(shù)測定茶樹根系氮吸收效率的方法切實有效。

2.2 茶樹根系表面氮離子的流動和吸收速率測定

茶樹氮離子流速指的是根系離子內(nèi)外交換過程中氮離子的運動速度，可以直觀的反映茶樹根系表面氮離子的流動方向和流動速率。在本試驗的濃度梯度下，LJ43和ZC108的根系表面氮離子的流動方向為內(nèi)流，即樣品均表現(xiàn)出吸收氮離子的狀態(tài)。

圖2 15N同位素標記測定9個茶樹品種的吸收速率差異

Fig. 215N isotopic labeling for detecting the absorption rates in 9 tea cultivars

圖3 基于15N同位素示蹤法檢測樣品根系對不同濃度氮素的吸收速率差異

兩茶樹品種的根系氮離子流速存在明顯差異（圖4）。樣品在0.05~5?mmol·L-1濃度內(nèi)的氮素吸收，均表現(xiàn)出對NH4+的偏好性。NH4+的吸收速率與培養(yǎng)液中NH4+濃度呈極顯著正相關(guān)（<0.01）。在0.05~5?mmol·L-1濃度下，隨氮濃度增加，LJ43對NH4+的吸收速率（均值）從221.397?pmol·cm-2·s-1增加至4?695.899?pmol·cm-2·s-1。ZC108對NH4+的吸收速率（均值）從48.039?pmol·cm-2·s-1增加至2?958.835?pmol·cm-2·s-1。LJ43對NH4+的吸收速率始終高于ZC108；LJ43對NO3-的吸收速率（均值）從62.905?pmol·cm-2·s-1增加至1?598.946?pmol·cm-2·s-1，ZC108對NO3-的吸收速率（均值）從35.799?pmol·cm-2·s-1增加至2?341.659?pmol·cm-2·s-1。NO3-的吸收速率與培養(yǎng)液中NO3-濃度也呈顯著正相關(guān)（<0.05）。在低濃度（0.05~0.5?mmol·L-1）氮處理下，LJ43對NO3-的吸收速率高于LJ43，在高濃度（2~5?mmol·L-1）下，ZC108和LJ43對NO3-的吸收速率出現(xiàn)與低濃度相反的趨勢，ZC108對NO3-的吸收速率超過LJ43。

基于NMT技術(shù)對LJ43和ZC108的吸收速率結(jié)果，進一步進行方法學(xué)分析?？芍貜?fù)性和穩(wěn)定性數(shù)值如表2所示。樣品吸收NH4+所測的數(shù)據(jù)點穩(wěn)定性和可重復(fù)性分別為87.12%~98.91%和94.19%~99.76%，均值分別為96.26%和96.72%。樣品吸收NO3-所測的數(shù)據(jù)點的穩(wěn)定性和可重復(fù)性分別在95.07%~99.36%和93.19%~99.17%，均值為分別為97.26%和96.59%。綜上，NMT技術(shù)的穩(wěn)定性與可重復(fù)性分別為95.22%和96.76%?？梢?，在不同氮形態(tài)、不同品種和不同濃度梯度的條件下，采用NMT技術(shù)測定茶樹根系氮素吸收的方法可重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高。

2.3 茶樹中氮素相關(guān)基因的表達

采用qRT-PCR技術(shù)，分析了在不同氮素濃度下，3個茶樹氮素吸收相關(guān)基因（，和）在LJ43和ZC108根部的表達水平（圖5）。結(jié)果表明，3個基因在不同氮濃度下均有表達。而同一品種不同氮濃度下和的表達量變化趨勢相同，但品種間在不同氮濃度下和基因表達量的變化趨勢存在差異。銨根轉(zhuǎn)運蛋白基因在兩個品種根部的表達量差異不顯著，表達無明顯規(guī)律，表明該基因?qū)Π睉B(tài)氮吸收的響應(yīng)不明顯。

圖4 NMT測定LJ43和ZC108在不同氮素梯度處理下的氮吸收速率差異

表2 NMT方法學(xué)參數(shù)比較

圖5 LJ43和ZC108根中 CsNRT2.4、CsNRT3.2和CsAMT1.2在不同氮素濃度處理下的表達量

茶苗經(jīng)過24?h氮素處理后，相比于基因，在兩個品種中表現(xiàn)出更強的誘導(dǎo)上調(diào)表達效應(yīng)。在2?mmol·L-1濃度下，在LJ43根中的表達量是0.05?mmol·L-1濃度下的252倍，而的表達量僅增加了3.4倍；當供應(yīng)5?mmol·L-1的NO3-時，在ZC108根中的表達量是0.05?mmol·L-1濃度下的66倍，而的表達量僅增加了2.7倍。這可能暗示著在茶樹對硝態(tài)氮的吸收過程中，起著主導(dǎo)作用。硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白基因和在LJ43中的表達量高于在ZC108中的表達量，表明LJ43在基因的轉(zhuǎn)錄水平對硝態(tài)氮吸收的響應(yīng)更強。

3 討論

本研究中15N和NMT技術(shù)測定的都是茶樹根系對氮素的吸收。但15N測定的是24?h的吸收狀態(tài)，而無機氮進入植物體內(nèi)，要經(jīng)過一系列生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為有機態(tài)氮，參與生命活動，在24?h的吸收中，氮素同化也在進行，對氮素代謝產(chǎn)生一定反饋作用，從而影響其氮素吸收效率[19]。在水稻、玉米、小麥等作物的研究中，均有證明在植株生長過程中存在氮的損失，且推測損失途徑可能是有葉片釋放氣體氮化物造成[37-39]。因此15N測定更偏向的是植物24?h后氮素積累的結(jié)果。而NMT測定的僅是瞬時吸收的速率。這可能是兩種方法測定的結(jié)果存在些許差異的原因。

在高氮處理下，LJ43對NH4+的瞬時吸收速率和24?h氮積累量均高于ZC108，而在低氮脅迫下，LJ43的瞬時吸收速率高于ZC108，但24?h氮積累量略低于ZC108。推測可能是LJ43對氮的響應(yīng)度高于ZC108，對NH4+更為敏感，在氮饑餓處理后回補氮素，瞬時吸收速率較高，但在長期低氮條件下，對于氮素的利用效率低于ZC108，表現(xiàn)為氮素積累量略低于ZC108。劉圓[18]在分析茶樹品種ZC108和LJ43的NH4+動力學(xué)吸收規(guī)律與本試驗結(jié)果相同，但其并未對NO3-進行分析。

本研究中，茶樹對于NH4+的瞬時吸收速率和24?h氮積累量均高于NO3-，驗證了茶樹具有較強的喜銨特性，同時也證明兩種方法在測定植物的氮吸收效率方面是可行的。對高等植物而言，NH4+和NO3-均為可利用的良好氮源。根據(jù)植物本身對2種不同形態(tài)氮素的喜好程度以及利用原理，可將植物分為喜銨植物和喜硝植物[40]。高濃度的銨態(tài)氮對包括木本植物在內(nèi)的大多數(shù)植物具有毒害作用，但高濃度的NH4+在本研究中并沒有影響茶樹的吸收，說明茶樹具有較強的吸收NH4+的能力。鄒春琴等[41]研究發(fā)現(xiàn)，與NO3-處理相比，NH4+處理下向日葵葉中K、Ca、Mg的濃度明顯降低，而且向日葵生物量會受到嚴重抑制。但在Ruan等[33]的研究中，在NH4+處理下，茶樹成熟葉和根中的GS酶活性及葉綠素含量均顯著提高。茶樹的喜銨特性可能是對栽培條件的長期適應(yīng)所形成的；可能是由于茶樹對銨態(tài)氮具有較高的吸收和同化能力，也可能和銨態(tài)氮同化的關(guān)鍵酶及基因有關(guān)[42-43]。

、和是課題組前期利用基因共表達網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心基因[44]，主要參與茶樹根系硝態(tài)氮和氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)運。本研究發(fā)現(xiàn)，LJ43的和表達量均高于ZC108，表明在分子層面上，LJ43對外界氮源的響應(yīng)高于ZC108，進一步說明LJ43對氮的敏感性高于ZC108。和在兩個品種中均表現(xiàn)為隨氮濃度增加誘導(dǎo)上調(diào)表達效應(yīng)，表明和的表達量一定程度上可以反應(yīng)茶樹硝態(tài)氮吸收的能力?；虻谋磉_水平與植物表型雖有關(guān)聯(lián)，但并非絕對的對應(yīng)關(guān)系。植物吸收土壤中的NO3-主要是在各種特定的根部轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)同作用下完成的，只有不同的轉(zhuǎn)運蛋白相互作用才能夠使根有效的吸收利用氮源，單一基因的表達并不能全面的反映植物對氮素的吸收規(guī)律[45]，CsNRT2.4和CsNRT3.2均為高親和硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白[34]，在低濃度下對NO3-的響應(yīng)度更高，高濃度時推測是其他低親和硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白在發(fā)揮主要作用，因此基因表達的規(guī)律與植物表型有可能存在一定偏差。在LJ43和ZC108根部的表達量均未呈現(xiàn)出特定規(guī)律，可能是取樣時間會影響其表達[34]，在茶樹根部的表達量是否能夠反映其對銨態(tài)氮吸收的能力還需要進一步驗證。

在研究茶樹氮素的吸收與利用方面，15N同位素示蹤技術(shù)是常用且比較精確的方法[23, 46]。而NMT技術(shù)在茶樹氮素上的應(yīng)用相關(guān)文獻較少，且未進行方法學(xué)驗證。本試驗嘗試對應(yīng)用該技術(shù)研究茶樹氮素吸收的效果進行方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示NMT技術(shù)的穩(wěn)定性高于15N技術(shù)，但重復(fù)性略低。NMT技術(shù)測定的是根系短時間內(nèi)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，而15N技術(shù)主要測定植株整體或部分器官對于營養(yǎng)物質(zhì)一定時間內(nèi)的積累，因此處理時間的長短可能是導(dǎo)致NMT技術(shù)穩(wěn)定性較15N技術(shù)高的因素。NMT技術(shù)的可重復(fù)性稍低，推測是因為二者的測定對象不同導(dǎo)致的。15N測定選用的是冷凍干燥后的無活性粉末，所以同一處理的反復(fù)觀測值間會更接近，而NMT是活體檢測，在測試根系處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，因此15N的可重復(fù)性較NMT略高，但NMT技術(shù)測定數(shù)據(jù)點的可重復(fù)性也可達90%以上，且具有保留待測植株活性的優(yōu)勢?？傮w而言，兩種方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性均超過85%，表明兩種方法均適用于茶樹營養(yǎng)代謝相關(guān)的研究，且各有側(cè)重，NMT可以測量短時間處理下的瞬時吸收速率，使用的試驗材料少，更適合茶樹氮吸收效率的早期鑒定。

茶樹作為多年生作物，育種年限長，開發(fā)快速有效的早期鑒定技術(shù)對于縮短育種年限具有重要意義。本研究中，NMT技術(shù)的可重復(fù)性、穩(wěn)定性均較高，且可保證供試茶苗的完整性和生理活性，初步認為其可以用于茶樹氮瞬時吸收速率的早期鑒定；和的表達量一定程度上可以反應(yīng)茶樹對硝態(tài)氮吸收的能力。此外，NMT技術(shù)在茶樹氮吸收速率測定方面的應(yīng)用推廣還需要后續(xù)更多品種鑒定數(shù)據(jù)支持。本研究可為氮高效茶樹品種的室內(nèi)早期鑒定技術(shù)建立提供了依據(jù)。

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Early Identification of Nitrogen Absorption Efficiency in Tea Plants

SU Jingjing1,2, RUAN Li1, WANG Liyuan1, WEI Kang1, WU Liyun1, BAI Peixian1,2, CHENG Hao1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Nitrogen is one of the most important elements for tea plants, and it has been over supplied in tea gardens, which not only results in the waste of resources, but also causes a series of environmental problems. Therefore, to breed tea cultivars with high nitrogen efficiency, it is necessary to establish an early detection of nitrogen usage rates which could be developed for screening the strains of tea plants. This study analyzed the absorption and utilization of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in two tea cultivars Longjing 43 (LJ43) and Zhongcha 108 (ZC108) under different nitrogen levels. The15N isotope labeling technology was applied to verify the feasibility and practicability of non-invasive micro-test technology (NMT) and real-time fluorescence quantitative (qRT-PCR) technology in early identification of nitrogen absorption and utilization abilities of tea lines. The purpose of this study was to establish an indoor early identification technology of nitrogen absorption efficiency for tea plants. The results show that the accuracy, stability and repeatability of15N were 85.16%, 89.51% and 99.26% respectively. While the accuracy, stability and repeatability of NMT were 91.35%, 95.22% and 96.76% respectively. The two methods showed that tea plants had obvious ammonium preference. Moreover, the expressions of nitrate transporter genesandwere up-regulated by nitrogen in both cultivars. Compared with ZC108, the expressions ofandin LJ43 were higher, indicating that the response of LJ43 to external nitrogen applications was higher than that of ZC108. Finally, it was preliminarily summarized that the NMT technology could measure the instantaneous absorption rate of tea plants in a short time with little loss of experimental materials. It might also be applied for the early detection of the instantaneous nitrogen absorption rates of tea plants. Meanwhile, the results also show that the expressions ofandcould partly reflect the nitrogen absorption ability of tea plants. This study provided a basis to develop techniques in early identification of high nitrogen-efficient cultivars in tea plants.

tea plants, nitrogen uptake rate, non-invasive micro-test technology (NMT),15N isotope-labeled, qRT-PCR

S571.1；S154.1

A

1000-369X（2020）05-576-12

2020-01-13

2020-03-17

中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610212018004）、浙江省農(nóng)業(yè)（茶樹）新品種選育重大科技專項（2016C02053-8）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-19）

蘇靜靜，女，碩士研究生，主要從事茶樹耐貧瘠育種研究。*通信作者：chenghao@tricaas.com