燕飛，蔣文華，曲東,2,3，付靜，趙璇

外源5-氨基乙酰丙酸對低溫脅迫下茶樹葉片光合及生理特性的影響

燕飛1,2,3,4，蔣文華1，曲東1,2,3，付靜1,2,3,4，趙璇4

1. 陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2. 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；4. 陜西理工大學秦巴紅茶研究所，陜西 漢中 723000

通過對陜茶1號（耐低溫型）和金牡丹（低溫敏感型）2個茶樹品種在冬季自然低溫脅迫下噴施不同濃度（0、10、30、50?mg·L-1）的外源5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA），探究外源ALA對低溫脅迫下茶樹葉片光合熒光特性及生理特性的調(diào)控作用。結(jié)果表明，適宜濃度的外源ALA對低溫脅迫下茶樹葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率、PSⅡ最大光化學效率及PSⅡ潛在活性具有促進作用，能夠提高水浸出物、咖啡堿、游離氨基酸、兒茶素類物質(zhì)、茶氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等生理活性物質(zhì)含量的累積；外源ALA能夠提高低溫脅迫下茶樹光合作用的能力并改善茶葉品質(zhì)，其中50?mg·L-1的ALA處理能有效提高陜茶1號應對低溫脅迫的能力，10?mg·L-1和30?mg·L-1的外源ALA對金牡丹應對低溫脅迫具有較好的緩解效用。

5-氨基乙酰丙酸；茶樹；低溫脅迫；光合特性；生理特性

陜南屬于我國江北茶區(qū)，冬季氣溫偏低、持續(xù)時間長（圖1），冬季低溫和早春“倒春寒”對該地區(qū)茶樹越冬和春季名優(yōu)茶生產(chǎn)造成很大的負面影響。低溫凍害會使茶樹葉片變紅，出現(xiàn)黑色斑點、焦枯、卷縮、易脫落等現(xiàn)象，甚至導致茶樹死亡，嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成重大的經(jīng)濟損失[1]。因此，如何提高茶樹抵御低溫的能力，減輕低溫脅迫對茶葉的產(chǎn)量及品質(zhì)的影響逐漸成為了茶葉越冬栽培的研究熱點。

5-氨基乙酰丙酸是四吡咯類化合物的前體物質(zhì)，是一種廣泛存在于微生物、植物和動物細胞中的非蛋白類氨基酸[2]，參與調(diào)節(jié)葉綠素的合成與代謝[3]。低濃度的ALA具有促進植物光合作用、提高PSⅡ反應活性、促進物質(zhì)累積等作用，可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑促進作物生長發(fā)育，緩解非生物脅迫對植物造成的傷害[4-8]?，F(xiàn)有研究表明，外源ALA能夠有效緩減干旱[9]、鹽漬[10]、低溫[11]等非生物脅迫對植物生長所產(chǎn)生的抑制效應，然而在提高茶樹抗寒方面的研究尚未見報道。因此，本試驗以陜茶1號（耐低溫型）和金牡丹（低溫敏感型）為試驗對象，噴施不同濃度的外源ALA，研究外源ALA對低溫脅迫下茶樹葉片光合及其生理特性的影響，探討外源ALA對低溫脅迫下茶樹光合調(diào)控及品質(zhì)積累的作用機制，為茶樹抗寒研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗場地位于陜西省漢中市南鄭區(qū)牟家壩鎮(zhèn)漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所茶樹種質(zhì)資源圃（海拔650?m，冬季常年平均氣溫低于4℃，極端天氣可達–14℃），供試材料為3年生的陜茶1號（耐低溫型）和金牡丹（低溫敏感型）。試驗小區(qū)長10?m，寬1.5?m，共栽培60株茶樹，采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理3個小區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理方法

試驗設(shè)4個處理，分別為0（噴施等量清水為對照）、10、30?mg·L-1和50?mg·L-1的ALA溶液（基于預試驗結(jié)果設(shè)置）。將不同濃度的ALA溶液每隔7?d噴施于茶樹正反葉面上，噴施標準以有水滴滴下為準，噴施時間為2019年2月11日至3月18日，共噴施6次。于3月25日（春茶采收生產(chǎn)前期，且天氣晴朗）早上8：30—11：30，每個小區(qū)隨機選取10株茶樹測定光合氣體交換參數(shù)，測定葉片均為頂芽下第三、四片無損傷、無病害、大小相近的健康葉片，隨后采集第四葉位以上健康新梢葉片固樣后粉碎，密封保存至–20℃冰箱，用于測定生理活性物質(zhì)。

圖1 試驗場地2019年1月至3月最低溫度

1.2.2 指標檢測方法

使用美國LI-COR公司生產(chǎn)的Li-6400XT便攜式光合儀對光合參數(shù)凈光合速率（）、胞間CO2濃度（）、氣孔導度（）、蒸騰速率（）等進行測定，并根據(jù)公式=/和=1－/，計算瞬間水分利用率（）和氣孔限制值（），其中，為葉外空氣CO2濃度。葉室溫度設(shè)定為28℃，照射光強為1?000?μmol·m-2·s-1，流速為500?μmol·mol-1。

固樣：將采集的葉片大約每100?g鮮葉用蒸鍋蒸青90?s，冷卻至常溫后于80℃烘箱烘干2?h，之后于50℃烘至茶葉可捏碎狀態(tài)，用粉碎機粉碎后過40目篩，密封保存置于–20℃冰箱備用[12]。

干物質(zhì)含量測定采用GB/T 8303—2013[13]，水浸出物含量測定采用GB/T 8305—2013[13]，游離氨基酸測定采用GB/T 8314—2013[13]，茶氨酸測定采用GB/T 23193—2017[13]，可溶性糖含量測定采用蒽酮–硫酸法[14]，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍-G250染色法[14]，參考薛金金等[15]方法測定兒茶素類物質(zhì)和咖啡堿含量。

將葉片暗適應20?min后使用OS-30P+植物脅迫快速測量儀測定PSⅡ最大光化學效率（/）和PSⅡ潛在活性（/）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所測數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行處理，使用IBM SPSS Statistics 20軟件進行Duncan’s多重比較分析（<0.05），使用GraphPad Prism 5進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ALA對茶樹葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

光合作用是植物將太陽能轉(zhuǎn)化為化學能并將無機物轉(zhuǎn)化為有機物的過程。光合速率的測量是研究植物光合性能、光合機構(gòu)運轉(zhuǎn)及環(huán)境因素對光合作用影響的重要方法。由表1可知，陜茶1號光合氣體交換參數(shù)的、、、等指標隨外源噴施ALA濃度升高呈上升趨勢，當外源ALA濃度為50?mg·L-1時均達到最大值，與對照相比，分別提高了30.99%、46.67%、5.08%和31.47%，差異顯著。隨著ALA濃度升高呈先下降后上升趨勢，濃度為30?mg·L-1時下降幅度最大，與對照相比降低了17.39%，而隨外源ALA濃度升高并未出現(xiàn)顯著差異。金牡丹的、、和變化趨勢隨外源ALA濃度升高呈先上升后下降趨勢，濃度為10?mg·L-1時達到最大值，分別比對照提高了26.10%、23.53%、8.31%和61.25%，差異顯著。隨外源ALA濃度升高呈先下降后上升趨勢，濃度為30?mg·L-1時下降幅度最大，與對照相比顯著下降了19.23%。10?mg·L-1外源ALA處理下，金牡丹與其他處理存在顯著性差異，相比對照顯著降低了21.93%。

2.2 外源ALA對茶樹葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)的變化在一定程度上可以反映植物在遇到環(huán)境脅迫時做出的響應，/和/值是反映茶樹葉片的最大光能轉(zhuǎn)化效率和光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性。如圖2所示，外源ALA處理均顯著增加了陜茶1號PSⅡ最大光化學效率，且PSⅡ最大光化學效率隨著濃度升高呈上升趨勢，當濃度為50?mg·L-1時達到最大值，比對照組顯著增加了6.1%。隨著外源ALA濃度升高，金牡丹的PSⅡ最大光化學效率呈先上升后下降趨勢，濃度為10?mg·L-1達到最大值，較對照組提高5.4%，差異顯著。

由圖3可知，外源ALA濃度為30?mg·L-1和50?mg·L-1時，陜茶1號PSⅡ潛在活性與對照組存在顯著性差異，分別比照組高13.4%和9.1%。與陜茶1號不同，3個濃度外源ALA處理均顯著提高了金牡丹的PSⅡ潛在活性，10、30?mg·L-1和50?mg·L-1的外源ALA分別比對照組高21.1%、12.6%、13.4%，而ALA各濃度處理之間并無顯著性差異。

表1 外源5-氨基乙酰丙酸對茶樹葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

注：2個品種每列不同的小寫字母表示在0.05水平有顯著差異。下同

Note: Different lowercase letters in each column of the two cultivars indicate significant difference at the level of 0.05. The same below

圖2 外源5-氨基乙酰丙酸茶樹葉片PSⅡ最大光化學效率的影響

圖3 外源5-氨基乙酰丙酸對低溫脅迫下茶樹葉片PSⅡ潛在活性的影響

2.3 外源ALA對茶樹葉片生理特性的影響

從表2可以看出，30?mg·L-1和50?mg·L-1的外源ALA處理均顯著提高了陜茶1號干物質(zhì)含量，其中50?mg·L-1的ALA效果最佳；3個外源ALA濃度處理對水浸出物的影響差異不顯著；咖啡堿、游離氨基酸、兒茶素類物質(zhì)、茶氨酸等含量隨著外源ALA濃度升高呈上升趨勢，濃度為50?mg·L-1時達到最大值，分別比對照高出17.87%、4.35%、27.79%和12.26%，且差異顯著。外源ALA處理提高了金牡丹干物質(zhì)、水浸出物、咖啡堿等內(nèi)含物的含量，隨著處理濃度的升高呈先上升后下降趨勢，30?mg·L-1的外源ALA最大限度的提高了金牡丹茶樹葉片的生理活性成分含量，其中水浸出物、咖啡堿、游離氨基酸、兒茶素類物質(zhì)和茶氨酸含量分別較對照組高20.23%、27.80%、24.06%、17.86%和68.78%，且存在顯著差異。

可溶性糖與可溶性蛋白不僅能為茶葉提供甜味，以及保持茶湯清亮，而且參與植物滲透調(diào)節(jié)，維持細胞內(nèi)滲透勢，具有維持細胞穩(wěn)定的功能。從圖4可以看出，經(jīng)ALA處理后，陜茶1號和金牡丹的可溶性糖含量隨外源ALA濃度升高呈先上升后下降趨勢，ALA濃度為30?mg·L-1時上升幅度最大，與對照相比分別上升了26.94%和47.49%，差異顯著。不同濃度對兩個不同耐低溫型茶樹品種可溶性糖無顯著影響。

表2 外源5-氨基乙酰丙酸對茶樹葉片生理活性成分的影響

圖4 外源5-氨基乙酰丙酸對茶樹葉片可溶性糖的影響

如圖5所示，噴施不同濃度外源ALA對陜茶1號和金牡丹可溶性蛋白含量的影響存在差異。噴施不同濃度外源ALA后，陜茶1號的可溶性蛋白含量明顯高于對照組，且隨著ALA處理濃度的升高呈上升趨勢，濃度為50?mg·L-1時達到最大值，較對照顯著提高了113.70%。金牡丹可溶性蛋白含量隨著外源ALA濃度升高呈先上升后下降趨勢，10?mg·L-1和30?mg·L-1的外源ALA處理使可溶性蛋白含量較對照分別提高33.82%和51.56%，當濃度為50?mg·L-1時其可溶性蛋白含量下降至對照水平。

3 討論與結(jié)論

植物光合作用是有機物的主要來源，光合作用可為茶樹碳、氮代謝提供碳源和能量[16-17]，溫度是影響茶樹進行光合作用的主要生態(tài)因子之一[18]。大量研究表明，低溫降低了植物的、、、和/，從而抑制其光合作用，進一步影響植物的生長[19-23]。本試驗結(jié)果顯示，與對照相比，噴施一定濃度的外源ALA可以提高陜茶1號和金牡丹茶樹的、、、，降低其和，這與低溫脅迫下茶樹[23]、玉米幼苗[5]和辣椒[24]植株的研究結(jié)果一致。低溫脅迫可直接損傷茶樹葉片的PSⅡ反應中心，導致茶樹光合作用能力減弱。ALA作為葉綠素合成的前體物質(zhì)，能夠促進低溫脅迫下茶樹光合作用，提高PSⅡ反應活性，提高植物應對低溫脅迫的能力。光合速率下降原因主要由和的變化方向來判斷，降低和升高，表明氣孔導度降低是光合速率降低的主要因素，增高和降低表明光合速率降低的原因是非氣孔因素[25]。本試驗中外源ALA處理使陜茶1號升高，和與變化趨勢一致，降低；金牡丹隨外源ALA處理濃度增大表現(xiàn)為先增高后降低，和與變化趨勢一致，表明氣孔導度是影響茶樹光合速率的主要因素，外源ALA促進了茶樹氣孔開放，葉片通過氣孔吸收環(huán)境中的CO2，加快CO2和H2O的交換速率，從而提高光合速率。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)外源ALA能夠提高冷脅迫下大甜瓜葉片的氣孔導度，進而提高光合速率；張治平等[27]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中過量合成ALA可以誘導葉片氣孔開放，促進CO2進入葉肉細胞，從而提高植物葉片凈光合速率；陳令會等[28]進一步驗證了ALA能夠促進光、暗條件下蘋果葉片氣孔開放，并阻止外源ABA和H2O2誘導的氣孔關(guān)閉，逆轉(zhuǎn)Ca2+誘導的氣孔關(guān)閉。而另一方面，ALA作為葉綠體的前體物質(zhì)，參與葉綠素的合成代謝，葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，其含量高低可以反映植物光合作用能力。有研究表明，外源ALA能夠提高春茶葉綠素含量[29]，因此推測，外源ALA能夠促進低溫脅迫下茶樹葉綠素合成，從而緩解低溫脅迫對光合作用的抑制，提高茶樹應對低溫脅迫的能力。而外源ALA提高茶樹光合速率可能受氣孔因素和非氣孔因素共同作用，此猜測仍需進一步驗證。此外，本研究中外源ALA處理后陜茶1號和金牡丹/和/顯著高于對照組，這與康瑯等[30]對西瓜葉片的研究結(jié)果一致，表明外源ALA可以提高茶樹葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，減輕低溫對PSⅡ反應中心損傷程度，促進葉片PSⅡ捕獲光能，有利于光合電子傳遞效率。

圖5 外源5-氨基乙酰丙酸對茶樹葉片可溶性蛋白的影響

咖啡堿、氨基酸、兒茶素類物質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)等是評價茶葉風味品質(zhì)成分的主要指標[31]，這些風味品質(zhì)成分共同決定著茶葉的滋味與口感，其含量決定著茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣[32-34]。郭湘等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與正常茶樣相比，受凍茶樣的水浸出物、游離氨基酸、兒茶素、咖啡堿均有不同程度的下降。本研究通過對2個品種茶樹外源噴施一定濃度ALA的試驗發(fā)現(xiàn)，與低溫脅迫對照相比，3個濃度的外源ALA均提高了2個茶樹品種的水浸出物、咖啡堿、游離氨基酸、兒茶素類物質(zhì)、茶氨酸等含量的積累，這與安玉艷等[29]研究外源ALA對春茶生長與品質(zhì)影響的試驗結(jié)果一致，可能是外源ALA緩減了低溫脅迫對茶樹的生長抑制，維持了細胞穩(wěn)定，緩減了低溫對細胞膜的傷害，促進了光合作用能力，提高光合作用轉(zhuǎn)化水平，有利于有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。茶鮮葉中蛋白質(zhì)的含量占干物質(zhì)總量的20%左右，它對保持茶湯清亮和茶湯膠體溶液的穩(wěn)定性起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片中可溶性糖含量隨低溫脅迫時間延長呈上升趨勢，可溶性蛋白含量隨著低溫脅迫的時間延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢[36]，本試驗中，茶樹通過外源ALA處理后，可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于對照組，表明外源ALA能夠提高逆境環(huán)境下植物可溶性糖和可溶性蛋白含量，這與外源ALA緩解鹽脅迫對顛茄生長抑制[37]和促進百合生長發(fā)育[38]的研究結(jié)果一致，究其原因，可能是外源ALA促進了水解酶類的活性，水解酶使碳水化合物大量水解形成可溶性糖，協(xié)調(diào)茶湯滋味，單寧酶將茶葉中的多酚類沒食子酸水解成咖啡堿和沒食子多酚類物質(zhì)。此外，低溫條件下外源ALA可能促進誘導產(chǎn)生新的蛋白使可溶性蛋白的含量增加，蛋白質(zhì)在蛋白酶的催化下水解成游離氨基酸，改善茶葉的鮮爽度。龍志榮等[39]研究發(fā)現(xiàn)，水解酶類與茶葉中可溶性糖、氨基酸、酚類物質(zhì)等密切相關(guān)，如水解酶中的纖維素酶濃度增加，單叢茶的水浸出物、氨基酸、可溶性糖、多酚類、咖啡堿的含量均顯著增加，水浸出物、氨基酸、多酚類含量隨蛋白酶濃度增加而增加。本研究通過對2個不同溫度敏感型的茶樹品種噴施3個濃度的外源ALA發(fā)現(xiàn)，不同品種對于不同濃度的外源ALA響應不同。50?mg·L-1的外源ALA處理對陜茶1號光合作用促進效果最佳，而金牡丹則在濃度為10~30?mg·L-1范圍內(nèi)響應強烈，產(chǎn)生這一差異可能與植物自身的形態(tài)、內(nèi)含物含量以及對外界低溫環(huán)境的響應不同等有關(guān)。植物的光合作用和光合活性會隨溫度變化而變化，而光合作用對溫度的敏感性與植物物種有密切關(guān)系，冷敏感的馬鈴薯在溫度從30℃降低到4℃時光飽和下的CO2吸收速率下降75%，最大量子效率降低50%，暴露于低溫下超過1?h則會發(fā)生不可逆的光合抑制現(xiàn)象，而抗冷性強的菠菜幾乎未受到影響[40]，可見，低溫敏感型物種其光合作用對溫度的響應更為敏感。低溫敏感型植物冰點較低，低溫脅迫會首先對細胞造成損傷，而在同等溫度下耐寒性物種未出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象[41]。植物遭受脅迫傷害時，細胞膜會受到損傷，產(chǎn)生脫水現(xiàn)象，此時植物會主動形成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，調(diào)整水分吸收，因此滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，低溫敏感型植物會在低溫條件下產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來應對低溫環(huán)境，這也是低溫條件下金牡丹可溶性糖和可溶性蛋白含量略高于陜茶1號的原因。

綜上所述，適宜濃度的外源ALA有利于低溫脅迫條件下茶樹進行光合氣體交換，促進光合作用，減輕低溫對PSⅡ反應中心損傷程度，從而提高茶樹應對低溫脅迫的能力，并提高茶樹葉片對光能的吸收及利用，茶葉中咖啡堿、游離氨基酸、兒茶素類物質(zhì)、可溶性糖、可溶性蛋白含量等生理活性成分含量增加，改善了茶葉品質(zhì)。然而不同品種的茶樹，由于對外界環(huán)境信號的應答不同，導致外源ALA對茶樹的作用效果產(chǎn)生濃度差異，具體響應機理，有待進一步深入分析和研究。

致謝：感謝漢中市農(nóng)業(yè)科學研究所席彥軍研究員為本試驗提供場地和現(xiàn)場指導，感謝漢中市質(zhì)量技術(shù)檢驗檢測中心張亦凡工程師在茶葉活性物質(zhì)測定方面給予的幫助和指導。

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Effects of Exogenous 5-aminolevulinic Acid on Photosynthetic and PhysiologicalCharacteristics of Tea Plants under Low Temperature Stress

YAN Fei1,2,3,4, JIANG Wenhua1, QU Dong1,2,3, FU Jing1,2,3,4, ZHAO Xuan4

1. College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 2. Shaanxi Bio-resources Key Laboratory, Hanzhong 723000, China; 3. Coordination and Innovation Center for Comprehensive Development of Qinba Biological Resources, Hanzhong 723000, China; 4. Qinba Black Tea Research Institute, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China

In order to explore the effects of 5-aminolevulinic acid (ALA) on photosynthetic and physiological characteristics of tea plants under natural low temperature stress in winter, we sprayed 0, 10, 30?mg·L-1and 50?mg·L-1ALA on ‘Shaancha 1’ (low temperature tolerant cultivar) and ‘Jinmudan’ (low temperature sensitive cultivar). The results show that ALA of suitable concentration could improve net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2concentration, transpiration rate, maximum photochemical efficiency of PSⅡ and potential activity of PSⅡ. Moreover, ALA treatment could promote the accumulations of water extract, caffeine, free amino acids, catechins, theanine, soluble sugar and protein contents. Exogenous ALA could improve the photosynthetic capacity and tea quality under low temperature stress. ALA treatment (50?mgL-1) could effectively improve the cold tolerance of ‘Shaancha 1’. While 10?mg·L-1and 30?mg·L-1ALA treatment had effects on the relief of low temperature stress in ‘Jinmudan’.

ALA, tea plants, low temperature stress, photosynthetic characteristics, physiological characteristics

S571.1

A

1000-369X(2020)05-597-10

2019-11-28

2020-02-13

陜西省教育廳項目（16JS019）、陜西理工大學博士啟動基金（SLGQD15-14）、陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目[QBXT-Z(Z)-15-2]

燕飛，男，講師，主要從事茶樹栽培抗逆生理和分子生物學方面研究，yanfei3111@163.com