杜小龍，張樂超，趙麗杰，喬 寧，高 明，李蘭會,3*,李祥龍

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定071000；2.華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北 邯鄲056000；3.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定071000；4.河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066004)

羽型是判定雛雞性別的重要表型性狀之一，其中主翼羽和覆主翼羽長度差異是在雞胚生長過程中形成[1]。最早研究發(fā)現(xiàn)慢羽K基因和禽內(nèi)源白血病毒ev21存在連鎖關(guān)系，并且普遍認為ev21病毒插入導(dǎo)致慢羽表型的形成[2-3]；后續(xù)研究重新定位K基因為包含催乳素受體(PRLR)在內(nèi)的基因重復(fù)[4-7]，2015年本課題組驗證了PRLR基因的部分重復(fù)序列是導(dǎo)致羽型差異的分子基礎(chǔ)，并且發(fā)現(xiàn)ev21與K基因并非緊密連鎖[2,8]，TAKENOUCHI等[9]也發(fā)現(xiàn)ev21整合不是慢羽的分子基礎(chǔ)。PRLR基因定位在雞Z染色體，其編碼蛋白催乳素受體PRLR包含1個跨膜域[10-13]。PRLR與其配體催乳素PRL結(jié)合可以影響甲狀腺激素分泌和NaCl再吸收等從而對雞胚的發(fā)育起關(guān)鍵作用[14]，有研究表明PRLR抑制毛囊發(fā)育[2,15]。PRLR基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多種剪切體，編碼不同類型的膜結(jié)合型蛋白，其主要區(qū)別為胞外域的組成成分和序列的長度[2,16]。雞PRLR的Ⅰ型剪切體(PRLRS1)，受組織特異性啟動子P1調(diào)控，主要在成年雞小腸和腎表達，而種屬特異啟動子P2調(diào)控的Ⅱ型剪切體(PRLRS2)在成年雞和胚胎組織中廣泛表達，并且P2啟動子與人、大鼠和小鼠廣泛表達的PRLR通用啟動子PⅢ具有高度同源性[17]。PRLR多種轉(zhuǎn)錄剪切體與其信號傳導(dǎo)途徑的多樣性以及配體功能多樣性、組織表達的廣泛性相適應(yīng)。在不同組織通過不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生剪切體，發(fā)揮其各自功能[2,18]。

本研究對快慢羽太行雞胚發(fā)育過程中翅羽皮膚組織PRLR基因的不同剪切體表達進行分析，并檢測快慢羽雞胚主翼羽和覆主翼羽長度變化，以揭示羽型形成與PRLR基因表達調(diào)控間關(guān)系，為快慢羽雞主翼羽和覆主翼羽長度差異形成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料62枚18胚齡和67枚19胚齡太行雞胚翅膀皮膚組織、主翼羽和覆主翼羽、肝臟均采集于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)太行雞孵化室；Easy Pure Genomic DNA Kit、TransZolTMUp PlusRNAKit、TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMIX、Trans 2K Plus DNA Marker均購自北京全式金公司；Super GelRedR、2×ES Taq MasterMix(Dye)購自保定康為世紀公司；引物合成及測序由華大科技公司完成。

1.2 主翼羽和覆主翼長度測量分別收集雞胚右翅由內(nèi)向外第1，2，3根主翼羽和覆主翼羽，測量長度(mm)，3根翅羽長度的平均值作為主翼羽和覆主翼羽的長度。

1.3 DNA、RNA提取及cDNA合成使用Easy Pure Genomic DNA Kit、TransZol TM Up Plus RNA Kit分別對肝臟、翅膀皮膚組織進行處理，提取DNA及總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Trans ScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super MIX將RNA合成cDNA。

1.4 太行雞胚羽型和性別檢測參考張秀玲等[6]試驗結(jié)果，合成羽型半定量鑒定引物1305和857；參考胡銳穎等[19]合成性別鑒定引物450-650。羽型和性別檢測擴增體系為：DNA 0.5 μL，Mix 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)分別0.5 μL，ddH2O補足10 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，退火30 s，72℃延伸 1 min 30 s，23～35個循環(huán)；72℃延伸10 min(表1)。

1.5 PRLR剪切體半定量檢測

1.5.1引物設(shè)計 NCBI下載PRLR的3種剪切體序列。Ⅰ型剪切體(PRLRS1，NM_204854.1)包含外顯子3(133 bp)，缺少外顯子8(121 bp)；Ⅱ型剪切體(PRLRS2，GQ184574.1)缺少外顯子3和8；Ⅲ型剪切體(PRLRS3，JX560222.1)有外顯子3和8。利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物PR2和PR3，并用NCBI數(shù)據(jù)庫檢測引物特異性(表1)。

表1 試驗用引物信息

利用引物PR2和PR3進行PCR擴增，檢測雞胚翅皮膚組織PRLR剪切體存在類型(圖1)。PR2擴增得到180 bp產(chǎn)物表明PRLRS2表達，得到313 bp 產(chǎn)物說明PRLRS1或/和PRLRS3表達；PR3擴增得到361 bp產(chǎn)物表明PRLRS1或/和PRLRS2剪切體表達，得到482 bp說明PRLRS3有表達。

圖1 PRLR剪切體與引物示意圖

1.5.2PRLR剪切體表達的半定量分析 將目的片段引物設(shè)置退火溫度梯度或循環(huán)次數(shù)梯度，確定引物擴增到達平臺期前的最適退火溫度及循環(huán)數(shù)，與β-actin內(nèi)參引物在同一條件下同時擴增。分別取2 μL 擴增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，每個樣本的目的產(chǎn)物與β-actin內(nèi)參產(chǎn)物在同一膠孔，通過產(chǎn)物大小確定雞胚翅皮膚組織PRLR剪切體類型，使用Image J軟件檢測分析內(nèi)參條帶與目的條帶灰度值(亮度)，以兩者的灰度值比值來表示不同剪切體相對表達量。

PCR反應(yīng)體系：0.4 μL cDNA，2×Es Taq MasterMix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，無核酸酶純水補足至10 μL。

PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火60℃ 30 s，72℃ 10 s，循環(huán)35次；72℃ 延伸10 min；4℃保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0一般線性模型分析胚齡、性別和羽型因素對主翼羽和覆主翼羽長和PRLR剪切體表達影響；單因素方差分析性別和胚齡對不同羽型雞羽長變化和PRLR基因剪切體表達變化，組間進行Duncan多重比較，α=0.05為影響顯著。

2 結(jié)果

2.1 DNA、總RNA提取及cDNA合成DNA、RNA和PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，可見條帶致密、整齊、清晰無拖尾，PCR擴增特異性強，沒有非特異性條帶和引物二聚體出現(xiàn)，片段長度與預(yù)期一致，完全滿足后期試驗。圖2為肝臟組織提取的基因組DNA、皮膚組織提取的總RNA和以cDNA為模板擴增內(nèi)參基因β-actin 的凝膠檢查結(jié)果。

圖2 DNA(A)、RNA(B)和β-actin(C)凝膠電泳檢測 A.太行雞肝臟組織提取基因組DNA;B.皮膚組織提取總RNA;C.以太行雞cDNA為模板擴增內(nèi)參基因β-actin的凝膠檢查結(jié)果。M.DL5000 DNA Marker；1～5.樣品

2.2 羽型和性別鑒定羽型性別鑒定檢測結(jié)果顯示857 bp為快羽慢羽表型，均有GHR基因擴增條帶；1 305 bp為慢羽雞PRLR重復(fù)特異條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，可見條帶清晰無拖尾，PCR擴增特異性強，沒有非特異性條帶和引物二聚體出現(xiàn)，片段長度預(yù)期片段長度一致，完全滿足下一步試驗(圖3)。

圖3 太行雞羽型(A)和性別(B)鑒定 A.羽型檢測結(jié)果(5,6,8.慢羽雞PCR產(chǎn)物;1,2,3,4,7.快羽雞PCR產(chǎn)物);B.性別鑒定結(jié)果(1,4.公雞;2,3,5,6,7,8.母雞)

2.3 主翼羽和覆主翼羽長度變化一般線性模型分析18胚齡(E18)和19胚齡(E19)不同性別快慢羽太行雞胚的主翼羽和覆主翼羽毛長，結(jié)果顯示胚齡和羽型對主翼羽和覆主翼羽長度影響的主效應(yīng)均極顯著存在(P<0.01)，而性別不影響太行雞主翼羽和覆主翼羽長度(P>0.05)(表2)。

進一步分析E18和E19的快慢羽太行雞胚主翼羽和覆主翼羽毛長，結(jié)果顯示快羽雞18和19胚齡的主翼羽均長于覆主翼羽1.5 mm以上(P<0.05)，而慢羽雞主翼羽略長于覆主翼羽0.4 mm以上(P>0.05)。18和19 胚齡的快慢羽雞胚主翼羽長存在顯著差異(P<0.05)，快羽和慢羽雞胚的主翼羽長在18胚齡已經(jīng)表現(xiàn)出顯著差異，快羽雞兩個胚齡的主翼羽均顯著長于慢羽雞2 mm左右?？煊痣u18胚齡的覆主翼羽長長于慢羽雞1 mm(P<0.05)，而在19胚齡時，兩羽型間覆主翼羽長度沒有顯著差異(P>0.05)。太行雞快慢羽型間主翼羽在18～19胚齡已經(jīng)表現(xiàn)并維持長度差異，覆主翼羽在18胚齡同樣表現(xiàn)出長度差異，但19胚齡兩羽型間覆主翼羽長度差異基本消失，快羽雞覆主翼羽生長速度降低(表3)。

表2 胚齡、性別和羽型對太行雞主翼羽和覆主翼羽長度主效應(yīng)的影響

2.4 PRLR基因剪切體半定量結(jié)果129枚雞胚翅羽皮膚中均檢測到PRLRS1和PRLRS2剪切體的各自目的帶313和180 bp以及與PRLRS1/PRLRS2共同表達目的條帶361 bp，未檢測到PRLRS3目的條帶482 bp，說明太行雞皮膚組織中存在PRLRS1和PRLRS2兩種剪切體類型。利用目的條帶313和180 bp 的灰度值分別與內(nèi)參目的條帶139 bp灰度值做比較，作為PRLRS1和PRLRS2剪切體的相對表達量(圖4)。

表3 兩種胚齡的快慢羽太行雞的主翼羽和覆主翼羽長度變化 mm

圖4 PRLR剪切體凝膠電泳檢測 1～5中361 bp條帶為PR3引物擴增產(chǎn)物;6～10中313 和180 bp條帶為PR2引物擴增產(chǎn)物；1～10中139 bp 條帶為β-actin引物PCR產(chǎn)物；M.DL5000 DNA Marker

2.5 羽型、胚齡和性別對PRLR剪切體表達影響胚齡、性別和羽型與PRLR兩種剪切體表達量關(guān)系結(jié)果表明，18和19胚齡兩種剪切體表達并沒有顯著性差異(P> 0.05)，不同性別之間也沒有顯著性差異(P> 0.05)，胚齡、性別對PRLRS1和PRLRS2表達都沒有影響。但兩種羽型間PRLRS2表達有顯著差異(P< 0.05)，說明PRLRS2表達可能是導(dǎo)致19胚齡后快慢羽羽長表型差異的主要原因，需進一步分析不同羽型的剪切體表達日齡變化(表4)。

2.6 兩種羽型的PRLRS1、PRLRS2表達隨日齡變化18和19胚齡剪切體PRLRS1表達量在快羽或慢羽系中并沒有隨時間推移發(fā)生顯著性變化(P>0.05)(圖5A)；剪切體PRLRS2表達量在18胚齡快、慢羽系間也沒有顯著差異(P>0.05)，但在19胚齡時慢羽表達量顯著高于快羽(P<0.05)(圖5B)。

表4 羽型、胚齡和性別對PRLR剪切體表達影響

3 討論

雞的羽毛顏色與其品種品系鑒定有關(guān)，在蛋雞的配套系生產(chǎn)中利用羽型進行商品代性別鑒定，PRLR基因的重復(fù)與慢羽表型連鎖，但是PRLR基因如何調(diào)控羽型形成尚不明確。羽型基因是伴性遺傳基因，并影響羽毛發(fā)育脫換[20]。婁義洲等[21]發(fā)現(xiàn)武農(nóng)I系烏骨雞的主翼羽和覆主翼羽長度差異隨生長階段不同發(fā)生變化，第2周齡開始快慢羽雞之間的毛長差異隨著日齡增長而減小[22]。趙彩娟等[23]測定2～10周齡壩上長尾雞翅羽長度，沒有發(fā)現(xiàn)不同羽型公雞2～10周齡主翼羽長度的顯著差異，但是不同羽型母雞的主翼羽長度具有顯著差異。本課題組對18和19胚齡快慢羽太行雞的主翼羽和覆主翼羽長度及PRLR基因表達進行研究，發(fā)現(xiàn)快羽雞的主翼羽均長于慢羽雞2 mm左右；18胚齡的快羽雞覆主翼羽長于慢羽雞，而19胚齡時快、慢羽雞覆主翼羽長度沒有差異，源于19胚齡時快羽雞覆主翼羽生長速度降低。另外，兩個胚齡快羽雞主翼羽平均長于覆主翼羽1.7 mm左右，而慢羽雞主翼羽僅長于覆主翼羽0.4 mm左右。認為是快羽太行雞19胚齡覆主翼羽生長速度較慢羽雞快、慢羽表型形成差異的原因之一。

圖5 兩種胚齡兩種羽型雞胚皮膚組織PRLRS1(A)和PRLRS2(B)表達變化

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在不同羽型太行雞皮膚組織中不存在PRLRS3剪切體，這與BU等[24]和CHEN等[25]在雞與鴿子上的研究結(jié)果一致。孵化期剪切體PRLRS1的表達在快慢羽間無顯著差異，而PRLRS2在19胚齡的慢羽雞表達顯著高于快羽，這與19胚齡慢羽雞的覆主翼羽生長速度的加快相對應(yīng)。但剪切體PRLRS2在快慢羽雞19胚齡的表達差異，是否影響覆主翼羽的生長變化，還需要深入細胞培養(yǎng)試驗深入研究。馮宇等[26]發(fā)現(xiàn)慢羽雞PRLR的mRNA表達高于快羽，但是蛋白表達無差異，BU等[24]發(fā)現(xiàn)PRLRS2與cPRL共轉(zhuǎn)染不能激活HepG2細胞熒光素酶活性，說明PRLRS2在毛囊發(fā)揮作用的方式可能和PRLRS1不一樣，是否PRLRS2可以和PRL結(jié)合需要進一步驗證。垂體組織未形成的早期雞胚中已有cPRL-L的廣泛表達[27]，PRL與PRLR相互影響，共同調(diào)控催乳素信號通路。在鼠和牛的研究中發(fā)現(xiàn)PRL與PRLR基因敲出或突變影響被毛的生長循環(huán)及其長度[28-30]。非哺乳動物家禽的PRLR基因表達變化，尤其是PRLRS2在慢羽雞19胚齡的高表達可能與其調(diào)控覆主翼羽的生長有關(guān)。其中PRLRS2與PRL如何通過催乳素信號系統(tǒng)發(fā)揮羽毛生長作用，現(xiàn)在不得而知，因此關(guān)于太行雞PRLR剪切體如何調(diào)控主翼羽和覆主翼羽生長還需進一步研究。