周志楠，陳 祥，敖 葉，洪 磊，韋仕南

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

組織蛋白酶(cathepsin,CTS)是一種主要定位于溶酶體中的酶類，參與人體和動(dòng)物的各種生理代謝過(guò)程，并被廣泛應(yīng)用于各個(gè)生物領(lǐng)域[1]。根據(jù)蛋白酶水解機(jī)制，主要分為半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease)、絲氨酸蛋白酶(serine protease)和天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)等幾個(gè)大類[2]。

其中，組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)由組織蛋白酶B1和B2構(gòu)成，從肝臟溶酶體中分離得到，是一種半胱氨酸蛋白酶。在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝中起重要作用，也可能涉及抗原加工等其他生理過(guò)程[3]，還有證據(jù)表明CTSB與一些慢性疾病與癌癥有關(guān)[4]。其結(jié)構(gòu)最早在鼠中被確定[5]，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其mRNA也在不同動(dòng)物的卵巢、肝臟、腦、脂肪和子宮等多個(gè)組織中廣泛表達(dá)，近期研究顯示CTSB能對(duì)卵巢的發(fā)育起到促進(jìn)作用，并可以提高卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量[6]。組織蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)是研究最為廣泛的組織蛋白酶之一，隸屬于天冬氨酸蛋白酶，1958年首次在魚(yú)肌中被發(fā)現(xiàn)[7]。它是一種酸性的組織蛋白酶，在細(xì)胞凋亡、卵巢的生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程中也具有十分重要的作用[8-9]。此外CTSD還被證實(shí)與癌癥等疾病密切相關(guān)[10]。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)CTSD基因能在豬卵巢顆粒細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、人體組織、雞乳、豬脾和牛肝等多個(gè)細(xì)胞或組織中表達(dá)[11-12]，其蛋白功能也最先在兩棲動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)[13]，目前CTSB和CTSD基因已在多種動(dòng)物中得到克隆和測(cè)序驗(yàn)證。

黔北麻羊主產(chǎn)于貴州北部的仁懷、習(xí)水兩地，屬短毛型皮肉兼用山羊，是當(dāng)?shù)貎?yōu)良品種，具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性廣和繁殖力高等特點(diǎn)。于2009年獲批為新遺傳資源，具有重要的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展?jié)摿?。近年?lái)黔北麻羊的研究集中在肉質(zhì)、生長(zhǎng)性能、繁殖性狀與基因多態(tài)、表達(dá)等方面[14-16]，但有關(guān)組織蛋白酶在黔北麻羊上的克隆與表達(dá)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)分析CTSB、CTSD基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)差異，克隆出黔北麻羊CTSB、CTSD基因完整的編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)進(jìn)一步探討CTSB、CTSD基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料黔北麻羊由貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司提供，分別選取成年產(chǎn)單羔、多羔的黔北麻羊母羊進(jìn)行屠宰并放血，黔北麻羊屠宰方法及其注意事項(xiàng)依據(jù)貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740-2017)進(jìn)行，屠宰前準(zhǔn)備液氮、酒精棉球、帶線圈沙袋、乳膠手套、一次性塑料手套、口罩、121℃高溫高壓滅菌后的剪刀、鑷子與錫箔紙，屠宰后分別采集產(chǎn)單羔、多羔黔北麻羊母羊的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個(gè)性腺組織，共10份組織樣品并使用滅菌的錫箔紙包住采集的組織后貼好標(biāo)簽置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2 試驗(yàn)試劑TRIzol@Reagent RNA提取試劑盒、熒光定量試劑UltraSYBR Mixture、膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司(北京)；StarScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genstar,美國(guó))；液氮(-196℃)、三氯甲烷、0.5% TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、西班牙瓊脂糖和氨芐青霉素(三水)均購(gòu)自艾瑞特(鼎國(guó))生物有限公司(貴州)；pMD19-T克隆載體、DNA Marker購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連)；T4DNA連接酶和LB Broth培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(上海)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)布的山羊(goat) Capra hircus CTSB、CTSD基因mRNA外顯子拼接序列(登錄號(hào)：NM_001314245.1、XM_018043344.1)；利用Primer Premier 5.064軟件分別設(shè)計(jì)熒光定量引物、CDS區(qū)克隆擴(kuò)增引物，引物序列、退火溫度(表1)。以β-actin為內(nèi)參基因。引物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。

表1 引物詳細(xì)信息

1.4 組織總RNA的提取與cDNA第1鏈的合成采用Trizol法提取組織總RNA，單、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢等10個(gè)性腺組織樣品總RNA提取后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)組織總RNA的純度、特異性和完整性，使用超微量分光光度測(cè)定儀測(cè)定組織總RNA的濃度和純度，觀察光密度比值(D260/D280)以及圖像是否合理，將峰圖單一、曲線平滑、D260/D2800比值在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)的組織總RNA于-80℃冰箱中保存。用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。采用GenStar的StarScript Ⅱ First-strand cDNA試劑盒將提取的組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，其中包括RNA模板1 μL、50 μmol/L Oligo dT Primer 1 μL、DEPC-ddH2O 7 μL、2× Reaction mix 10 μL、StarScript Ⅱ RT mix 1 μL。PCR反應(yīng)條件為42℃孵育30～50 min，85℃孵育5 min，產(chǎn)物于-20℃ 冰箱保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR以逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA第1鏈為模板結(jié)合SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)產(chǎn)單、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢等性腺組織中的表達(dá)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括cDNA模板0.8 μL、2×Real Star Green Fast Mixture 10 μL、正向引物與反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL、RNase-free H2O 7.6 μL。采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，具體程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 2 min；95℃變性15 s，退火30 s，熔解曲線由機(jī)器自動(dòng)設(shè)置(基礎(chǔ)溫度65℃，每5 s增加0.5℃擴(kuò)增至95℃)(表1)。試驗(yàn)所得Cq值經(jīng)過(guò)MS Office處理后利用相對(duì)定量法2-ΔΔCt=2-[(目的樣品Ct-內(nèi)參基因Ct)-(對(duì)照樣品Ct-內(nèi)參基因Ct)]計(jì)算目的基因CTSB、CTSD mRNA的相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 19.0軟件對(duì)2-ΔΔCt相對(duì)定量法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)與配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，使用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，分別以P<0.05、P<0.01為差異顯著性、極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 PCR擴(kuò)增黔北麻羊CTSB、CTSD基因CDS區(qū)以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA第1鏈為模板對(duì)目的基因CTSB、CTSD的CDS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中2×Es Taq Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA第1鏈模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，引物退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 5 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物置于4℃冰箱保存， 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否有目的條帶(表1)。

1.7 目的基因CTSB、CTSD的克隆將瓊脂糖凝膠上的目的條帶切割放入2 mL透明離心管中進(jìn)行膠回收，按照北京康為世紀(jì)有限公司膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)膠回收產(chǎn)物濃度與純度，并與pMD19-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)(金屬浴16℃，12 h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)涂板、37℃恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取白斑放入含氨芐青霉素的裝有LB液體培養(yǎng)基的10 mL離心管中，37℃，200 r/min搖12～16 h，待菌液渾濁后立即進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌液PCR產(chǎn)物；篩選目的條帶正確的陽(yáng)性菌液送至生工生物(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.8 黔北麻羊CTSB、CTSD基因生物信息學(xué)分析測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)DNAStar軟件比對(duì)正確后，應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)黔北麻羊CTSB、CTSD基因的編碼序列進(jìn)行同源性分析，分別應(yīng)用在線ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)和ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)分析黔北麻羊CTSB、CTSD基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與疏水性；用在線軟件SOPMA(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi -bin/npsa_auto mat.pl?page=npsa_sopma.html)與SWISS-MODEL(www.swissmodel.expasy.org)程序預(yù)測(cè)CTSB、CTSD蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用PSORT Ⅱ Preadict(https://psort.hgc.jp/form2.html)軟件對(duì)CTSB、CTSD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用SignalP 4.1 Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)預(yù)測(cè)氨基酸序列的信號(hào)肽及剪切位點(diǎn)，最后利用MEGA6.0軟件構(gòu)建CTSB、CTSD基因編碼的氨基酸序列在不同物種中的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增黔北麻羊CTSB、CTSD基因以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板對(duì)CTSB、CTSD基因熒光定量引物與CDS區(qū)克隆引物進(jìn)行擴(kuò)增，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的基因CTSB(A)、CTSD(B)熒光定量產(chǎn)物，擴(kuò)增出約為182和185 bp條帶，與預(yù)測(cè)片段大小一致，且條帶清晰、單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增、證明目的基因CTSB、CTSD熒光定量引物特異性良好，可用于下一步試驗(yàn)研究(圖1A,B)。PCR擴(kuò)增目的基因CDS區(qū)克隆產(chǎn)物 C、D可知，條帶明亮，擴(kuò)增出約為1 008和1 239 bp 大小的片段，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，可用于下一步試驗(yàn)研究(圖1C,D)。

2.2 CTSB、CTSD基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)CTSB基因mRNA在單、多羔黔北麻羊的卵巢組織中的表達(dá)量最高，在下丘腦中的表達(dá)量最低，兩者之間差異極顯著(P<0.01)，CTSB基因mRNA在單、多羔黔北麻羊卵巢組織中的表達(dá)量均極顯著高于其他組織(P<0.01)，其在單、多羔黔北麻羊中的表達(dá)順序一致、依次為：卵巢>輸卵管>垂體>子宮>下丘腦。組間比較可知，CTSB基因mRNA在多羔黔北麻羊垂體與子宮中的表達(dá)量極顯著高于單羔黔北麻羊(P<0.01)，在輸卵管與卵巢中的表達(dá)量高于單羔黔北麻羊，但沒(méi)有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)(圖2)。CTSD基因組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)mRNA在單、多羔黔北麻羊卵巢組織中的表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)，在子宮組織中的表達(dá)量最低。CTSD基因mRNA在單羔黔北麻羊的表達(dá)量依次為卵巢>輸卵管>下丘腦>垂體>子宮；在多羔黔北麻羊的表達(dá)量依次為卵巢>垂體>輸卵管>下丘腦>子宮。由組間比較得出，CTSD基因在多羔黔北麻羊卵巢、垂體、輸卵管中的表達(dá)量極顯著高于單羔黔北麻羊，其余組織均未達(dá)到顯著性差異(P<0.05)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CTSB、CTSD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 A.CTSB基因熒光引物；B.CTSD基因熒光引物;C.CTSB基因CDS區(qū)序列；D.CTSD基因CDS區(qū)序列。M,M1.DL2000 DNA Marker;1～6.CTSB基因熒光引物擴(kuò)增產(chǎn)物；7～12.CTSD基因熒光引物擴(kuò)增產(chǎn)物;1′～3′. CTSB基因CDS區(qū)片段;4′～9′.CTSD基因CDS區(qū)片段

圖2 CTSB基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)量 注：不同大寫(xiě)字母A、B、C表示同一物種在不同組織間極顯著差異(P < 0.01);**.表示同一組織在不同物種之間極顯著差異(P < 0.01)。下同

2.3 CTSB、CTSD基因T克隆載體的鑒定與測(cè)序鑒定將目的基因CTSB、CTSD與pMD19-T連接后，經(jīng)涂板轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑挑菌后，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，菌液PCR條帶位置與目的條帶位置一致，1 008 bp代表CTSB基因CDS區(qū)片段，1 239 bp代表CTSD基因CDS區(qū)片段，目的條帶明亮，滿足下一步試驗(yàn)要求(圖4)。陽(yáng)性菌液測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示黔北麻羊CTSB基因與NCBI上傳的山羊CTSB基因序列吻合度高達(dá)99.91%，第919位堿基由A突變?yōu)門，氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸。黔北麻羊CTSD基因與NCBI公布的山羊CTSD基因序列吻合度達(dá)到100%，無(wú)堿基、氨基酸的突變。菌液PCR與測(cè)序驗(yàn)證證明目的基因pMD19-T-CTSB和pMD19-T-CTSDT克隆載體構(gòu)建成功。

圖3 CTSD基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達(dá)量

圖4 CTSB、CTSD基因菌液PCR檢測(cè)結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～6.CTSB基因；7～10.CTSD基因

2.4 黔北麻羊CTSB、CTSD基因CDS區(qū)生物信息學(xué)分析

2.4.1黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 黔北麻羊CTSB基因CDS區(qū)包含1 008 bp，共編碼335個(gè)氨基酸，ExPASy Protparam在線程序分析顯示CTSB的分子式為C1623H2444N438O491S26，原子總數(shù)為5 022，編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為36 780，理論等電點(diǎn)為5.65；該蛋白中甘氨酸(Gly)的含量最多，占氨基酸總量的11.0%，谷氨酰胺(Gln)與甲硫氨酸(Met)的含量最少，各占氨基酸總量的2.4%。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為65.16(不穩(wěn)定指數(shù)>53.0)，提示該蛋白可能為相對(duì)不穩(wěn)定蛋白；CTSD基因CDS區(qū)包含1 239 bp，共編碼412個(gè)氨基酸，其分子式為C2008H3154N524O586S18，包括6 290個(gè)原子，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為44 590，理論等電點(diǎn)為7.03；該蛋白中甘氨酸(Gly)的含量最多，占氨基酸總量的10.0%，色氨酸(Trp)的含量最少，占氨基酸總量的1.0%，Protparam在線程序分析出該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為37.82，提示該蛋白可能為相對(duì)穩(wěn)定蛋白。

進(jìn)一步使用ProtScale程序分析CTSB、CTSD蛋白的疏水性并生成檢測(cè)圖譜，橫坐標(biāo)為編碼蛋白的氨基酸位置，縱坐標(biāo)為蛋白疏水性分值，0分以下表示親水，0分以上表示疏水。CTSB蛋白第9，10位絲氨酸、半胱氨酸的疏水性最強(qiáng)為2.467，第220位賴氨酸的親水性最強(qiáng)為-2.500，負(fù)值氨基酸數(shù)量多于正值氨基酸，證實(shí)該蛋白為親水性蛋白(圖5A)。CTSD蛋白第13位亮氨酸的疏水性最強(qiáng)，分值為2.889，第126位天冬酰胺的親水性最強(qiáng)，分值為-2.678，正值氨基酸略多于負(fù)值氨基酸，證實(shí)CTSD蛋白可能為疏水性蛋白(圖5B)。

圖5 CTSB(A)、CTSD(B)蛋白疏水性圖譜

2.4.2黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測(cè) 依據(jù)在線SOMPA軟件預(yù)測(cè)黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTSB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種結(jié)構(gòu)組成，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大為54.03%，其次為α-螺旋占22.99%，延伸鏈所占比例為14.93%，最后β-轉(zhuǎn)角占比7.28%；CTSD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)共有4種結(jié)構(gòu)組成，無(wú)規(guī)則卷曲占41.75%，其次為延伸鏈，所占比例為31.07%，α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為19.90%與7.28%，得出CTSB、CTSD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低。隨后，使用SWISS-MODEL軟件進(jìn)一步對(duì)CTSB、CTSD蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CTSB蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋組成，CTSD蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)更多則是由無(wú)規(guī)則卷曲與延伸鏈組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致(圖6)。

圖6 黔北麻羊CTSB(A)、CTSD(B)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖像

2.4.3黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析與信號(hào)肽預(yù)測(cè) 運(yùn)用PSORT Ⅱ Prediction在線程序?qū)TSB、CTSD蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)黔北麻羊CTSB蛋白有66.7%的可能定位在細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)、位于細(xì)胞核、空泡與線粒體的比例相同，均為11.1%；黔北麻羊CTSD蛋白有44.4%的可能位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)；22.2%的可能位于空泡；細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)膜各占11.1%。再使用SignalP 4.1在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)黔北麻羊CTSB、CTSD基因編碼的氨基酸序列中是否存在潛在的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，選擇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN法)預(yù)測(cè)氨基酸的信號(hào)肽位點(diǎn)，橫坐標(biāo)表示氨基酸的位置，縱坐標(biāo)表示信號(hào)分值，結(jié)果可知，黔北麻羊CTSB基因編碼氨基酸序列具有信號(hào)肽，且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)在第17號(hào)與第18號(hào)氨基酸之間(圖7A);黔北麻羊CTSD基因編碼氨基酸序列也具有信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)位于第22～23號(hào)氨基酸 (圖7B)。

圖7 黔北麻羊CTSB(A)、CTSD(B)編碼氨基酸信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

2.4.4CTSB、CTSD氨基酸同源性分析 運(yùn)用DNAStar軟件對(duì)不同物種CTSB、CTSD氨基酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示黔北麻羊CTSB基因編碼的氨基酸序列與綿羊、牛、牦牛、虎鯨、駱駝、豬、雞、大鼠、小鼠與人的相似性分別為99.4%，95.2%，94.6%，90.4%，87.8%，90.4%，77.0%，78.2%，78.5% 和81.0%，說(shuō)明CTSB基因編碼的氨基酸序列在不同物種之間均具有較高的相似性(圖8A)；進(jìn)一步利用MEGA6.0軟件構(gòu)建不同物種CTSB基因編碼氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果證實(shí)黔北麻羊與綿羊的親緣關(guān)系最近，與牛、牦牛親緣關(guān)系較近，與人、大鼠、小鼠、雞的親緣性相對(duì)較遠(yuǎn)(圖9A)。

黔北麻羊CTSD基因編碼氨基酸序列與綿羊、牛、牦牛、虎鯨、駱駝、豬、雞、大鼠、小鼠與人的相似性分別為98.5%,96.8%,97.1%,87.6%,70.2%,86.8%,66.8%,80.1%,79.0%和84.6%，由數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，CTSD基因編碼氨基酸序列在不同物種之間也具有較高的保守性，黔北麻羊CTSD氨基酸序列與綿羊的相似性最高，與雞的相似性最低(圖8B)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明哺乳動(dòng)物聚成一個(gè)大的分支，黔北麻羊CTSD基因編碼氨基酸序列與綿羊的遺傳距離最近，與牛、牦牛的遺傳距離相對(duì)較近，與雞、大鼠、小鼠的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)(圖9B)。

圖8 不同物種CTSB(A)、CTSD(B)基因編碼氨基酸序列比較

3 討論

組織蛋白酶家族均歸屬于水解酶，是一大類蛋白水解酶，具有水解蛋白的能力。自從20世紀(jì)20年代提出組織蛋白酶的概念以來(lái)，到目前為止組織蛋白酶A～Z都已有報(bào)道[17]。組織蛋白酶B、D都是組織蛋白酶家族被研究最廣泛、最常見(jiàn)的成員，目前CTSB和CTSD已經(jīng)在常見(jiàn)動(dòng)物豬、綿羊、水產(chǎn)動(dòng)物、特種動(dòng)物旋毛蟲(chóng)等多種動(dòng)物中克隆并測(cè)序驗(yàn)證[18-20]，其mRNA也在多種組織器官中廣泛表達(dá)[21]。但近年來(lái)，關(guān)于組織蛋白酶的研究多是與疾病、癌癥、免疫反應(yīng)有關(guān)[22]，其在黔北麻羊中的調(diào)控機(jī)制與組織表達(dá)譜尚不明確。

圖9 不同物種CTSB(A)、CTSD(B)氨基酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

本研究成功克隆了黔北麻羊CTSB、CTSD基因編碼序列并與NCBI-GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊CTSB基因編碼序列與山羊CTSB基因編碼序列匹配度達(dá)到99.91%，第919位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)突變?yōu)榻M氨酸(His)，黔北麻羊CTSD基因編碼序列與山羊CTSD基因編碼序列匹配度高達(dá)100%；氨基酸的突變是否會(huì)導(dǎo)致黔北麻羊CTSB蛋白功能的變異還需要后續(xù)驗(yàn)證。信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白具有信號(hào)肽，CTSB蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第17～18號(hào)氨基酸，而CTSD蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第22～23號(hào)氨基酸，此結(jié)果與陳磊等[23]在豬上對(duì)CTSB的研究結(jié)果一致、與潘俐玲等[24]在水產(chǎn)動(dòng)物上對(duì)CTSD的研究結(jié)果一致，說(shuō)明黔北麻羊CTSB、CTSD蛋白可能是一種分泌蛋白；經(jīng)氨基酸同源性比較與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊CTSB、CTSD基因編碼氨基酸序列與綿羊、牛、牦牛、虎鯨等大型哺乳動(dòng)物的同源性相對(duì)較高，遺傳距離相對(duì)較近，與人、雞、大鼠、小鼠等動(dòng)物的同源性相對(duì)較低，遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，黔北麻羊CTSB基因編碼氨基酸序列與其余10個(gè)物種相比同源性均在77.0% 以上，而CTSD基因編碼氨基酸序列與其余10個(gè)物種相比同源性均在66.8%以上，提示CTSB、CTSD基因在遺傳進(jìn)化的過(guò)程中保守性較高，氨基酸不易發(fā)生改變。理化性質(zhì)、疏水性分析與亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)黔北麻羊CTSB蛋白可能是一種位于細(xì)胞外(細(xì)胞壁)(66.7%)的不穩(wěn)定親水性蛋白，CTSD蛋白是一種位于細(xì)胞外或細(xì)胞壁(44.4%)的穩(wěn)定疏水性蛋白，這分別與孫銘苑等[25]的對(duì)豬帶滌蟲(chóng)以及祁昕等[26]對(duì)綿羊CTSB的分析結(jié)果一致，與王念璐等[27]對(duì)天府肉羊CTSD的分析結(jié)果一致；蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明黔北麻羊CTSB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋構(gòu)成，CTSD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲與延伸鏈組成，依然與祁昕等[26]對(duì)CTSB的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)CTSB與CTSD能以多種形式存在，其在細(xì)胞或組織中的作用也不同。鄧桂馨等[21]研究表明CTSB廣泛分布于哺乳動(dòng)物的肝、脾、腎、骨、神經(jīng)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等各種組織中。而CTSD也分別在心、肝、脾、子宮和卵巢等組織中檢測(cè)出[28]。本研究利用qRT-PCR法對(duì)目的基因在單、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個(gè)性腺組織中的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示CTSB、CTSD基因mRNA在這些組織中均有不同程度的表達(dá)，AHN等[29]研究CTSB蛋白在雞的卵巢中有分布，在雞癌變的卵巢中有大量的表達(dá)，ASHRY等[30]利用轉(zhuǎn)錄本技術(shù)分析得出CTSB mRNA在卵丘細(xì)胞中的豐度較其他組織高，SONG等[31]得出CTSB和CTSD在綿羊子宮內(nèi)膜中呈低度表達(dá)。這些結(jié)果與本研究得出CTSB與CTSD基因mRNA在單、多羔黔北麻羊的表達(dá)譜一致。此外BALBOULA等[32]研究發(fā)現(xiàn)CTSB對(duì)卵巢細(xì)胞的影響較大并能夠參與細(xì)胞凋亡，故其mRNA在卵細(xì)胞中較為活躍。也有較多的研究證實(shí)CTSB對(duì)卵巢細(xì)胞的凋亡有很大的相關(guān)性。CTSD作為天冬氨酸蛋白酶家族成員同樣也對(duì)細(xì)胞凋亡有影響、還能夠參與卵泡的發(fā)育與成熟。研究表明CTSD mRNA在草魚(yú)性腺組織中的表達(dá)量高于其他組織[33]，同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)CTSB、CTSD基因在單、多羔黔北麻羊卵巢組織中的表達(dá)量最高。這提示CTSB、CTSD可能參與卵巢組織的生殖調(diào)控且對(duì)產(chǎn)羔性狀有一定的影響。