田發(fā)益，劉貴芳，武俊喜

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 生物技術(shù)中心，西藏 林芝 860000；2.中國科學(xué)院 地理科學(xué)與資源研究所 生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

藏系綿羊是西藏畜牧業(yè)的主要支柱，也是特殊地域長期自然選擇的習(xí)服動(dòng)物。在長期自然選擇和適應(yīng)進(jìn)化下，形成了耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、抗缺氧的特殊體能。據(jù)2018年西藏統(tǒng)計(jì)年鑒資料統(tǒng)計(jì)[1]，2017年，西藏全年羊存欄數(shù)1 087萬只，綿羊存欄數(shù)700萬只。全年羊總體出欄數(shù)397.19萬只，年出欄率35.14%。同時(shí)，項(xiàng)目組對(duì)西藏羊的體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)1歲以上茨蓋母羊平均體質(zhì)量(25.7±2.2)kg，2歲以上西藏母綿羊平均體質(zhì)量(26.0±1.6)kg，2歲以上西藏公綿羊平均體質(zhì)量(38.2±0.6)kg。藏系綿羊的出欄時(shí)間一般為2年或2年以上，飼草轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)性能低下。

彭波半細(xì)毛羊是20世紀(jì)90年代利用當(dāng)?shù)夭匮驗(yàn)槟副?，新疆?xì)毛羊、茨蓋半細(xì)毛羊?yàn)楦副具M(jìn)行級(jí)進(jìn)雜交，再導(dǎo)入適量茨蓋半細(xì)毛羊血液后，橫交固定、培育的毛肉兼用半細(xì)毛羊新品種。彭波半細(xì)毛羊主要飼養(yǎng)于拉薩地區(qū)林周縣。據(jù)2019林周縣統(tǒng)計(jì)，全縣現(xiàn)有彭波半細(xì)毛羊存欄總數(shù)4.3萬只，其生產(chǎn)性能優(yōu)于藏系綿羊，適應(yīng)高原環(huán)境的一個(gè)培育品種。

現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中，精準(zhǔn)配方和精準(zhǔn)補(bǔ)飼是養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵。代謝組學(xué)提供了研究的新方法，通過分析和判斷羊飼養(yǎng)過程中養(yǎng)分變化對(duì)機(jī)體代謝的影響程度，調(diào)整補(bǔ)飼料或優(yōu)化配方，以提高養(yǎng)殖效率，減少代謝性疾病的發(fā)生。代謝組學(xué)主要研究小分子代謝物整體數(shù)量、種類及變化規(guī)律[2]。研究方法一般有LC-MS、GC-MS和NMR，分析的代謝產(chǎn)物一般為小分子物(MW<1 000)，并將該變化特征與代謝通路和生物學(xué)事件或過程相聯(lián)系(常用的數(shù)據(jù)庫有HMDB、KEGG、UMBBD、Biocyc、Metacye、Lipid Search、BioSilico和Metcore等)[3]，分析其機(jī)理和代謝特征。營養(yǎng)代謝組學(xué)可以定量、大范圍地研究有機(jī)體營養(yǎng)調(diào)控時(shí)出現(xiàn)的動(dòng)態(tài)代謝應(yīng)答，可準(zhǔn)確和深入地掌握營養(yǎng)、環(huán)境等因素與生產(chǎn)性能間產(chǎn)生的相互作用。

試驗(yàn)通過非靶向代謝組學(xué)法，分析放牧環(huán)境和全舍飼環(huán)境下，彭波半細(xì)毛羊血清中代謝物的差異情況，分析這些代謝物與之關(guān)聯(lián)的代謝通路，找出原因，進(jìn)行飼草料合理搭配和補(bǔ)飼，扶正各代謝通路，提高羊的養(yǎng)殖效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、飼養(yǎng)管理試驗(yàn)用彭波半細(xì)毛羊均來自于西藏自治區(qū)拉薩市林周縣白朗村養(yǎng)羊合作社。研究區(qū)拉薩市林周縣白朗村(N29°50′～E91°5′)是西藏河谷地帶典型的半農(nóng)半牧村，屬于高原溫帶季風(fēng)半干旱氣候區(qū)，年平均氣溫在2.4～8.2℃，年降雨量300 ～500 mm，集中在6-9月份，日溫差較大。白朗村天然草地占該村總面積的80%以上。白朗村養(yǎng)羊合作社共飼養(yǎng)600多只羊，屬科研院所與村合作示范基地。舍飼組和放牧組各選用2歲左右的母羊10只，平均體質(zhì)量為(23.77±2.34) kg，每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只。

放牧組，采用西藏常規(guī)全天放牧方式，每天晚上羊群混喂約50 g/只玉米粉和適量鹽。

舍飼組，飼用飼料為課題組研發(fā)的全價(jià)TMR“草餅干”(表1)，TMR“草餅干”規(guī)格為32 mm×32 mm 的長方體，且固化成型，長短從3 ～5 cm不等。每只羊每天按規(guī)定分2次飼喂，總量為1.43 kg，根據(jù)采食情況，上下20%左右浮動(dòng)，自由飲水。

表1 “草餅干”主要養(yǎng)分含量 kg

表2 舍飼組和放牧組飼草中主要養(yǎng)分含量(風(fēng)干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

1.2 儀器與試劑正纈氨酸、正亮氨酸、甲醇、N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)、甲氧胺鹽酸鹽和無水吡淀均購自西格瑪奧德里奇公司。

1.3 試驗(yàn)羊血清采集試驗(yàn)始于2018年青藏高原牧草發(fā)青季6月份，嚴(yán)格按要求進(jìn)行飼喂5個(gè)月后進(jìn)行采樣分析。采樣時(shí)，放牧組和舍飼組各隨機(jī)選取2個(gè)重復(fù)中的彭波半細(xì)毛羊5只，于飼喂前或放牧前，抽取羊頸靜脈血，1 000×g離心15 min，抽取血清，速置于干冰環(huán)境下貯存。樣品于當(dāng)天由鐵路送往青海西寧，再從西寧托運(yùn)至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)測定分析。

1.4 樣品處理代謝物提取與衍生物制備：于冰水浴解凍血清樣本，渦旋振蕩，取100 μL與400 μL冰冷甲醇(含內(nèi)標(biāo)5 mg/L的正亮氨酸)混合，渦旋振蕩60 s，-20℃靜置過夜，4℃ 14 000×g離心15 min。取70 μL上清液，在氮?dú)庀聯(lián)]干。向干燥物中加入50 μL 20 mg/L鹽酸甲氧胺吡啶溶液，渦旋振蕩30 s，37℃孵育90 min。加入50 μL BSTFA (含1% TMCS)，70℃衍生60 min，得到三甲基硅烷化衍生血清樣本。按QC樣本制備方法，從所有血清樣本中取相同體積樣本混合并等分，并在每批樣本分析測試時(shí)按相同方法制備和分析QC樣本。

1.5 GC-MS檢測GC-MS設(shè)定：載氣為高純(純度大于99.999%)氦氣，流速1 mL/min。采用梯度升溫程序?qū)颖具M(jìn)行分離分析。梯度升溫程序?yàn)椋浩鹗?0℃維持1 min，以15℃/min升到240℃，繼續(xù)以40℃/min升至320℃并維持4 min。以無分流模式進(jìn)樣1 μL，溶劑延遲時(shí)間設(shè)定為5.4 min。進(jìn)樣口、傳輸線和電子碰撞(EI)電離源溫度分別設(shè)定為250，260，230℃。EI能量設(shè)定為70 eV。采用全掃描方式對(duì)質(zhì)荷比(m/z)范圍為50～600的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析對(duì)GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行變量(保留時(shí)間-質(zhì)荷比)和積分面積的Excel數(shù)據(jù)文件，再對(duì)Excel中峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行面積百分比歸一化處理。得到數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到瑞典Umetrics AB公司SIMCA軟件(版本14.1)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析如主成分分析(PCA)、偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)和正交過濾偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)。分析前首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行默認(rèn)的平均中心化(mean-centered)和UV(unit variance)格式化處理，然后自動(dòng)計(jì)算最優(yōu)主成分?jǐn)?shù)和建立最優(yōu)模型。為了避免模型過擬合，采用SIMCA軟件默認(rèn)的7-循環(huán)交叉驗(yàn)證計(jì)算主成分的最優(yōu)數(shù)。模型質(zhì)量評(píng)價(jià)參數(shù)為R2X或R2Y和Q2值。

結(jié)合OPLS-DA模型的變量投影重要性(Variable importance in the projection，VIP)>1和單維統(tǒng)計(jì)分析的P<0.05相結(jié)合的方法篩選差異性代謝物。倍數(shù)變化(Log2FC)計(jì)算方法為放牧組(T組)和舍飼組(X組)兩組數(shù)據(jù)均值之比的對(duì)數(shù)(以2為底)，正值表示該物質(zhì)在T組中的水平高于X組，負(fù)值則相反。

用模型質(zhì)量參數(shù)R2X(X模型的解釋率)，R2Y(Y觀察量即組間差異的解釋率),Q2(預(yù)測率)來表示模型質(zhì)量，一般來說，值大于0.5，即表示模型質(zhì)量較好。由SIMCA-P(14.1版本)自動(dòng)進(jìn)行模型構(gòu)建，當(dāng)模型過擬合時(shí)，不再計(jì)算新主成分，此時(shí)的所有主成分就是有效的主成分，建立的模型即為有效模型(非過擬合的)。

2 結(jié)果

2.1 代謝物的差異性分析采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(閾值>1)結(jié)合單維檢驗(yàn)的P值(閾值<0.05)尋找差異性表達(dá)代謝物。本試驗(yàn)共篩選并定性到24個(gè)差異性物質(zhì)，其中13個(gè)物質(zhì)下降，11個(gè)物質(zhì)上升。差異性代謝物數(shù)據(jù)如表3所示(P<0.05)。Log2FC(T/X)正值，表示X組飼代謝物濃度>T組；若為負(fù)值，則表示T組代謝物濃度>X組。VIP值即變量投影重要性，從OPLS-DA模型獲得。Log2 FC為倍數(shù)變化值，T和X組歸一化的峰面積均值之比的對(duì)數(shù)值(以2為底)，正號(hào)表示該物質(zhì)在T組中的平均信號(hào)響應(yīng)值或濃度值大于X組，負(fù)號(hào)則表示該物質(zhì)在T組中的平均信號(hào)響應(yīng)值或濃度值小于X組。

表3 T和X組差異性代謝物

2.2 對(duì)比和檢驗(yàn)分析主成分分析(PCA)見圖1A。采用SIMCA(版本14.1)軟件對(duì)彭波半細(xì)毛羊血清樣本進(jìn)行主成分分析，建立含3個(gè)有效主成分的PCA模型，模型累積解釋率R2X=0.627。一般來說，R2X>0.5表示該模型可靠。血清PCA得分如圖1所示：橫坐標(biāo)表示第1主成分即PC1，用t[1]表示；縱坐標(biāo)表示第2主成分即PC2，用t[2]表示。PCA得分圖顯示T與X組分別分布于得分圖的上方和下方，證明兩組之間有分離，說明T和X組樣本之間有代謝差異。

偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)見圖1B。本項(xiàng)目建立含2個(gè)有效主成分的PLS-DA模型，R2X=0.283，R2Y=0.926，Q2=0.071 6。對(duì)模型的參數(shù)值(看R2Y和Q2值)進(jìn)行分析，表明當(dāng)前模型可靠。置換檢驗(yàn)(Permutation test，圖1D)表明當(dāng)前模型質(zhì)量較差(Q2最右側(cè)點(diǎn)Y軸值小于大多數(shù)左側(cè)點(diǎn)的Y軸值)。因PLS-DA是監(jiān)督性方法，模型必須非過擬合才有效，Permutation test主要用于檢測表征模型是否過擬合。本項(xiàng)目結(jié)果表明當(dāng)前的PLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象(即零假設(shè)不成立)，Q2斜線與Y軸切割點(diǎn)值小于0表示當(dāng)前模型非過擬合，本試驗(yàn)值為-0.030 6，因此PLS-DA模型有效。

圖1 樣本和QC樣本得分圖 A.主成分分析;B.偏最小二乘方-判別分析PLS-DA;C.偏最小二乘方-判別分析OPLS-DA;D.置換檢驗(yàn)

正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)(圖1C)。采用SIMCA(版本14.1)軟件對(duì)樣本自動(dòng)建立含1個(gè)主成分和1個(gè)正交成分的OPLS-DA模型，模型主要質(zhì)量參數(shù)為R2X=0.479，R2Y=0.987，Q2=0.889，表明當(dāng)前模型可對(duì)T組和X組兩組樣本進(jìn)行有效區(qū)分。

2.3 相關(guān)性矩陣與熱圖分析為了表征各差異性代謝物之間的(濃度)相關(guān)性，對(duì)這些代謝物的定量信息進(jìn)行皮爾森相關(guān)性(Pearson Correlation)分析(基于R平臺(tái)，版本3.3.0)，如圖2所示，每一行和每一列都表示差異性代謝物,方塊大小和顏色深淺跟差異性代謝物之間的相關(guān)性有關(guān)。紅色表示差異性代謝物之間呈正相關(guān)，綠色表示差異性代謝物之間呈負(fù)相關(guān)。顏色越深，方塊越大，相關(guān)性越大。

為了表示兩組樣本的差異性代謝物之間的關(guān)系，對(duì)這些代謝物差異性物質(zhì)的定量信息進(jìn)行heatmap分析(R平臺(tái)，版本3.3.0)，如圖3所示，每行表示差異性代謝物，每列表示樣本編號(hào)，左側(cè)的樹狀結(jié)構(gòu)表示差異性代謝物之間相似度聚類關(guān)系。紅色表示差異性代謝物在樣本中的濃度是上升的，綠色表示差異性代謝物在樣本中的濃度是下降的。

2.4 KEGG通路分析通過對(duì)代謝物元素和代謝通路進(jìn)行聯(lián)系(表4)，并對(duì)某一代謝通路中涉及的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即通過原數(shù)據(jù)的差異顯著性分析(RawP)，共發(fā)現(xiàn)有8類代謝通路在T和X組間表達(dá)差異顯著(P<0.05)；采用Holm-Bonferroni法分析，即兩兩差異性比對(duì)的形式，發(fā)現(xiàn)僅有纈氨酸(Valine)、亮氨酸(leucine)和異亮氨酸(isoleucine)生物合成代謝通路差異顯著。采用FDR分析，兩組間差異顯著的也為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝通路。采用通路拓?fù)浞治鲇?jì)算分析，影響兩組的代謝通路仍為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝通路。

圖2 T和X組差異性代謝物的相關(guān)性矩陣圖

表4 T和X組的代謝通路差異性結(jié)果

采用在線軟件Metabo Analyst(版本4.0 http://www.metaboanalyst.ca/)對(duì)差異性代謝物進(jìn)行代謝途徑分析，代謝組學(xué)繪圖(圖4)。圖4中體現(xiàn)顯著變化的代謝通路。由于羊代謝涉及到腸道菌群，故必需氨基酸合成途徑也包含在內(nèi)?？v坐標(biāo)P表示代謝通路富集分析中該通路中代謝物與分類不相關(guān)的可能性，P值越大表示該途徑代謝物與分類相關(guān)的可能性越小，P值越小表示該途徑代謝物與兩組相關(guān)的可能性越大。為了便于繪圖的直觀效果，縱坐標(biāo)用其對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)表示，因此，P越小，-log(P) 越大。圖中，縱坐標(biāo)越大的點(diǎn)表示該通路與分組越相關(guān)。顏色越紅相關(guān)性越大。橫坐標(biāo)(pathway impact value)值基于路徑拓?fù)浞治?，表示該通路?duì)放牧組與舍飼組差異發(fā)生的重要性，圓圈越大，重要性越大。

從表5可知，T和X組中，因飼草料的變化而影響的代謝通路主要有：纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，丙酮酸代謝，糖酵解和糖質(zhì)新生。這些代謝通路中，主要涉及氨基酸代謝和能量代謝。

圖4 T和X組差異性代謝途徑富集分析

表5 T與X組間差異性代謝產(chǎn)物參與的代謝通路

3 討論

3.1 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(支鏈氨基酸)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸在疏水脂質(zhì)鏈上都具有分支的甲基集團(tuán)[4]。在本次試驗(yàn)中，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫檢索分析，與支鏈氨基酸代謝相關(guān)的代謝物有3種，兩個(gè)測試組中差異顯著，這些代謝物為丙酮酸、異亮氨酸和纈氨酸。丙酮酸是糖酵解的產(chǎn)物，血液中乳酸與丙酮酸具有一定的比例，經(jīng)測定，血清中的比例約為4∶1(血清及血清蛋白)。支鏈氨基酸生物合成途徑中有4個(gè)公共酶系，分別為乙酰羥酸合成酶AHAS、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶AHAIR、二羥酸脫水酶DHAD和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶TAs及各自獨(dú)特的合成酶系[5]。放牧組中纈氨酸和異量亮酸均顯著高于舍飼組，但丙酮酸含量舍飼組高于放牧組。支鏈氨基酸的合成是一系列酶相互作用的結(jié)果，受許多因素的反饋抑制。支鏈氨基酸在細(xì)胞內(nèi)外差別特別大，血清中過量的支鏈氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，影響整體的發(fā)酵產(chǎn)酸水平[6]。說明適當(dāng)?shù)牡鞍罪暳纤娇纱龠M(jìn)糖酵解和降低支鏈氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞的傷害，同時(shí)適當(dāng)?shù)陌被岜壤欣跈C(jī)體自身蛋白質(zhì)的合成。

3.2 氨酰tRNA生物合成本研究結(jié)果顯示影響氨酰tRNA生物合成的代謝物主要有賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和脯氨酸4種，放牧組均顯著高于舍飼組。氨酰tRNA的合成，受氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRS)作為催化特定氨基酸與tRNA結(jié)合的關(guān)鍵酶，通過催化氨基酸與相應(yīng)tRNA的氨?；?，以保證遺傳信息翻譯的準(zhǔn)確性，在生物體內(nèi)具有重要作用[7]。aaRS對(duì)不同底物的選擇性以及催化方式都存在較大差別[8]，但催化反應(yīng)在本質(zhì)上是一致的[9]，不合理的氨基酸比例或抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)的形成是有影響的。此4類氨基酸在放牧組羊血清中的高含量，說明其他氨基酸的攝入量不足，很大程度上也影響了細(xì)胞合成自身蛋白的翻譯能力；另一方面，也說明此4類氨基酸的攝入量足夠或通過瘤胃微生物的轉(zhuǎn)化量足量，可在進(jìn)行飼料補(bǔ)飼過程適當(dāng)減少添加量。

3.3 泛酸鹽和CoA生物合成CoA是體內(nèi)70多種酶反應(yīng)通路的輔助因子，是體內(nèi)重要的酰基載體，主要是參與糖代謝、脂肪酸合成與氧化、血紅素的合成、丙酮酸的降解、氨基酸分解代謝、乙酰膽堿合成與乙?；确磻?yīng)過程[10-11]。纈氨酸含量的升高(放牧組)，說明泛酸鹽和CoA的生物合成受到影響，即能量和物質(zhì)的累積也受到了影響，影響泛酸鹽和CoA生物合成的主要代謝物有纈氨酸和尿嘧淀，放牧組血清中纈氨酸含量高于舍飼組，而舍飼組尿嘧淀含量較高于放牧組。盡管尿嘧淀舍飼組中的含量(0.548 8±0.057 0)mmol/L相對(duì)于放牧(0.480 5±0.020 0)mmol/L較高，但值差異不大，不影響泛酸鹽和CoA的生物合成。說明合理的蛋白飼料，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的沉積，加速物質(zhì)的新陳代謝。

3.4 精氨酸和脯氨酸代謝檢測中發(fā)現(xiàn)影響精氨酸和脯氨酸代謝的物質(zhì)主要有脯氨酸、丙酮酸和鳥氨酸3種。小腸是精氨酸和脯氨酸合成的重要場所。精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺同屬于精氨酸家族氨基酸，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)可相互轉(zhuǎn)化，上述氨基酸及其代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)可發(fā)揮多種生理功能[12]。精氨酸是調(diào)控脂肪酸氧化分解為水和CO2的關(guān)鍵基因表達(dá)，加速脂肪代謝，促進(jìn)脂肪分解[13]。同時(shí)，精氨酸代謝產(chǎn)生的鳥氨酸會(huì)轉(zhuǎn)化成多胺和NO。多胺(腐胺、亞精胺、精胺、尸胺)是一類普遍存在的陽離子胺，參與包括胃腸道在內(nèi)的多種組織的細(xì)胞增殖和分化[14]。脯氨酸和鳥氨酸在放牧組血清總含量較高，說明精氨酸和脯氨酸代謝通路中，某一反應(yīng)酶或底物受到抑制，或此反應(yīng)體系中某些反應(yīng)底物的不足。精氨酸和脯氨酸平衡的打破，影響了腸道上皮的正常功能，也會(huì)弱化部分信號(hào)傳導(dǎo)和代謝的正常進(jìn)行。

3.5 丁酸甲酯代謝放牧與舍飼組變異較大的代謝物有2種，分別為丙酮酸和3-羥基丁酸，均表現(xiàn)為舍飼組高于放牧組。3-羥基丁酸是脂肪降解旁路過程中形成丁酸甲酯的中間產(chǎn)物，與丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸轉(zhuǎn)化為丁酸甲酯相關(guān)，同時(shí)也與維生素B6代謝相關(guān)，降解產(chǎn)物為酮體、丁烷、丙酮酸鹽、丁醇等產(chǎn)物。β-羥基-β-丁酸甲酯(HMB) 是亮氨酸的代謝中間產(chǎn)物，可調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)的合成和分解代謝，并能維持細(xì)胞膜的完整性[15]。說明舍飼羊隨著脂肪的沉積和高蛋白的攝入，這些物質(zhì)的分解供能也在不斷加強(qiáng)。

3.6 丙酮酸代謝和糖酵解和糖質(zhì)新生代謝在丙酮酸代謝和醣酵解與糖異生代謝通路中，舍飼組乳酸和丙酮酸鹽含量均高于放牧組。丙酮酸是糖酵解的最終產(chǎn)物，在機(jī)體的胞漿中還原成乳酸，在線粒體內(nèi)生成乙酰CoA，再進(jìn)行三羧酸循環(huán)。因此，丙酮酸通過乙酰CoA和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)3大營養(yǎng)物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化，是重要的代謝產(chǎn)物。乙酰輔酶A(acetyl-A)是一種別構(gòu)劑，是激活糖異生的丙酮酸羧化酶，抑制糖有氧氧化中丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性，促進(jìn)糖異生作用[16]。當(dāng)機(jī)體能量足夠時(shí)，三羧酸循環(huán)被抑制，CoA堆積，抑制了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性。同時(shí)，丙酮酸羧化酶被激活，加速了糖異生過程，多余的丙酮酸生成葡萄糖[17]。健康動(dòng)物機(jī)體中的乳酸堆積一般有過勞運(yùn)動(dòng)、消化道攝取等。但當(dāng)能量供應(yīng)充足，糖酵解速率超過有氧氧化速率，或糖異生受阻等因素，會(huì)在體內(nèi)堆積過量乳酸。結(jié)果可知，在舍飼組中加入過多的能量飼料，不利于羊的飼料轉(zhuǎn)化，造成家畜代謝障礙。

3.7 谷胱甘肽代謝γ-谷氨?；h(huán)完成GSH和谷氨酸的相互轉(zhuǎn)換，而γ-氨基丁酸是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由L-谷氨酸脫羧而產(chǎn)生。谷胱甘肽(GSH)存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞，其半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)(-SH)。GSH具有解毒、參與生物轉(zhuǎn)化和保持正常的免疫系統(tǒng)的功能。因此，谷氨酸受體根據(jù)其生化屬性及功能被分為兩種類型—代謝型和離子型[18]。代謝型谷氨酸受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)，影響許多細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控神經(jīng)興奮、突觸形成及神經(jīng)變性的第二信使系統(tǒng)。同時(shí)，代謝型谷氨酸受體也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理標(biāo)志之一[19]。但舍飼組中多聚谷氨酸含量的升高，不代表病理反應(yīng)，其機(jī)理還不清楚。

分析中，影響谷胱甘肽代謝的代謝物主要有多聚谷氨酸，舍飼組顯著高于放牧組；鳥氨酸在放牧組體內(nèi)顯著高于舍飼組。精氨酸酶催化，水解生成尿素和鳥氨酸[20]。鳥氨酸的代謝產(chǎn)物，多胺廣泛參與體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要的生理過程。體內(nèi)多胺的合成、降解及攝取均受到嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)多胺的代謝出現(xiàn)紊亂，相繼會(huì)引起多種病疾[21-23]。從放牧組血清中鳥氨酸含量的相對(duì)堆積，可能會(huì)引起調(diào)節(jié)因子多胺的分泌量不足，不利于家畜的生長發(fā)育。

本研究通過對(duì)西藏彭波半細(xì)毛羊血清非靶向代謝組學(xué)的研究，自然狀態(tài)放牧組和舍飼組存在主要差異的代謝通路有：放牧組代謝物堆積引起的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、氨酰tRNA生物合成、泛酸鹽和CoA生物合成、精氨酸和脯氨酸循環(huán)代謝出現(xiàn)阻滯或障礙，影響機(jī)體蛋白質(zhì)合成。舍飼組中因能量飼料供給過剩，出現(xiàn)丁酸甲酯代謝、丙酮酸代謝和醣酵解與糖異生代謝循環(huán)中的代謝物堆積，在飼料配方中，應(yīng)降低能量飼料的比例。谷胱甘肽代謝通路中，放牧組鳥氨酸血清含量極高，鳥氨酸代謝會(huì)產(chǎn)生多胺等神經(jīng)遞質(zhì)，鳥氨酸代謝紊亂，影響體細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要的生理過程。