殷生良，孫雅靜，侯婷婷

遼寧省沈陽市骨科醫(yī)院小兒骨科，遼寧沈陽 110000

骨肉瘤是一種起源于間質(zhì)細胞的肌肉-骨骼惡性腫瘤，骨肉瘤的發(fā)生率約為百萬分之三，男性骨肉瘤的發(fā)生率高于女性[1]。骨肉瘤的易發(fā)部位為長骨的髓端，尤其是在膝關(guān)節(jié)周圍的股骨遠端和肱骨近端。骨肉瘤病程進展迅速，發(fā)病率和病死率高[2]。目前，骨肉瘤的治療主要有手術(shù)、化療、免疫治療等。骨肉瘤細胞的強大增殖能力和耐藥性是影響預(yù)后的重要因素[3]。盡管阿霉素是晚期骨肉瘤化療的主要藥物之一，但有40%～45%的骨肉瘤患者對阿霉素?zé)o反應(yīng)，或僅部分反應(yīng)，阿霉素耐藥的發(fā)生是骨肉瘤化療失敗的主要原因。因此，為了開發(fā)更有效的治療方法，探索骨肉瘤耐藥的分子機制十分重要。

在過去的幾十年里，研究者從表觀遺傳學(xué)、細胞周期和凋亡、自噬等方面進行了研究。諸如ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因及凋亡相關(guān)的重要通路[4]，被證實在腫瘤細胞耐藥中發(fā)揮重要作用。但是，骨肉瘤耐藥的分子機制尚不完全清楚，相關(guān)靶向藥物仍缺乏臨床療效。近年來，隨著人類基因組計劃的完成和高通量測序技術(shù)的進步，研究人員已逐漸將研究中心放在非編碼RNA(ncRNA)的生物學(xué)功能上。ncRNA在調(diào)控基因表達中起著至關(guān)重要的作用[5]。其中，有一類長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，廣泛參與生物體的生命過程，并發(fā)現(xiàn)多種lncRNA可參與腫瘤耐藥的發(fā)生過程。因此，進一步明確lncRNA參與骨肉瘤阿霉素耐藥的分子機制十分必要。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)lncRNA PANDAR在骨肉瘤細胞中過表達，抑制lncRNA PANDAR后可抑制骨肉瘤細胞增殖，促進凋亡，并可抑制骨肉瘤細胞對阿霉素的耐藥性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 骨肉瘤細胞Saos-2、U2OS、MG-63，人正常成骨細胞NHOst，阿霉素耐藥(DOX)骨肉瘤細胞MG-63/DOX購自美國菌種保藏中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibico公司；無菌培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；PANDAR si-RNA、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)過表達質(zhì)粒及定量引物購自中國吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；PCR引物購自中國生工生物工程有限公司；Bcl-2抗體、SYRB Green染料及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR(qPCR)儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 配制含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，同時加入1%青、鏈霉素用于細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)箱條件：37 ℃，5%CO2，細胞克隆至80%～90%更換培養(yǎng)基。

1.2.2qPCR 檢測人正常成骨細胞NHOst和骨肉瘤細胞株中PANDAR的表達。TRIzol法提取總RNA，并檢測純度及濃度。依據(jù)Takara公司說明書進行反轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)。lncRNA PANDAR的上游引物序列為5′-TAA GGT GGT GGC ATT GAG-3′，下游引物序列為5′-CAG GTC TTG GAT TGA GGA A-3′；Bcl-2的上游引物序列為5′-TGT GGA TGA CTG AGT ACC T-3′，下游引物序列為5′-CAG AGA CAG CCA GGA GAA-3′；U6作為內(nèi)參進行相對定量，U6的上游引物序列為5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列為5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。2-ΔΔCt法計算兩者的相對表達水平，重復(fù)3次。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 依據(jù)基因轉(zhuǎn)染操作手冊，Lipofectamine 2000將過表達和沉默載體轉(zhuǎn)染至細胞。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，觀察細胞生長情況，收集細胞用于進一步研究。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法 提取細胞總蛋白，制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣；80 V濃縮膠，120 V分離膠進行電泳，100 V轉(zhuǎn)膜90 min，5%牛血清清蛋白封閉聚偏二氟乙烯膜1 h，加一抗，4 ℃振蕩過夜。TBST洗滌后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，顯影成像。特異性條帶灰度值由ImageJ 軟件獲取。

1.2.5CCK-8試驗評估細胞增殖能力 遵照CCK-8試劑盒說明書進行。細胞接種于96孔培養(yǎng)板，于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h加入CCK-8試劑，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，多功能酶標儀測定吸光度值(A450)，評估細胞增殖情況。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.6Annexin V-FITC PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理后，用4 ℃磷酸鹽緩沖液對細胞進行胰蛋白酶化和洗滌。根據(jù)操作手冊，使用Annexin V-FITC PI檢測試劑盒在黑暗中孵育細胞懸液15 min。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA PANDAR在人正常成骨細胞、骨肉瘤細胞、MG-63/DOX中表達情況 qPCR檢測lncRNA PANDAR在細胞株中的表達，骨肉瘤細胞Saos-2、U2OS、MG-63中l(wèi)ncRNA PANDAR的相對表達水平分別為(3.21±0.50)、(3.33±0.45)、(4.21±0.61)，較人正常成骨細胞NHOst中的lncRNA PANDAR的相對表達水平(1.00±0.21)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時與MG-63中相對表達水平(1.00±0.20)比較，lncRNA PANDAR在MG-63/DOX相對表達水平(2.03±0.33)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2下調(diào)lncRNA PANDAR抑制Bcl-2的表達 將PANDAR的兩條siRNA干擾序列分別轉(zhuǎn)染進入MG-63細胞，qPCR結(jié)果顯示，lncRNA PANDAR相對表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，在MG-63細胞中沉默lncRNA PANDAR后，Bcl-2的相對表達水平也隨之下降(P<0.05)。其中第2條序列(si-lncRNA PANDAR2)具有更好的沉默效能，用于后續(xù)實驗。經(jīng)過轉(zhuǎn)染si-lncRNA PANDAR2后，MG-63細胞中Bcl-2蛋白的相對表達水平也明顯減低(P<0.05)。見圖2。

注：圖A表示lncRNA PANDAR在Saos-2、U2OS、MG-63和NHOst細胞中相對表達水平；圖B表示lncRNA PANDAR在MG-63和MG-63/DOX細胞中相對表達水平。

注：圖A表示轉(zhuǎn)染si-lncRNA PANDAR前后MG-63細胞中l(wèi)ncRNA PANDAR相對表達水平；圖B表示轉(zhuǎn)染si-lncRNA PANDAR后MG-63細胞中Bcl-2的mRNA相對表達水平；圖C表示轉(zhuǎn)染si-lncRNA PANDAR后MG-63細胞中Bcl-2的蛋白表達情況。

2.3lncRNA PANDAR和Bcl-2對骨肉瘤細胞增殖、凋亡能力的影響 CCK-8和Annexin V-FITC PI檢測PANDAR和Bcl-2對MG-63細胞增殖和凋亡的影響。將si-lncRNA PANDAR2轉(zhuǎn)染MG-63細胞，細胞的增殖能力減弱，證明隨著lncRNA PANDAR表達的減少，細胞的增殖能力隨之下降。在此基礎(chǔ)上過表達Bcl-2，被抑制的細胞增殖能力部分恢復(fù)(P<0.05)。將si-lncRNA PANDAR2轉(zhuǎn)染MG-63細胞，細胞凋亡明顯增加，從2.20%增加至18.89%，而過表達Bcl-2后，凋亡細胞降至2.03%(P<0.05)，表明lncRNA PANDAR對MG-63細胞凋亡的影響依賴Bcl-2。見圖3、4。

圖3 lncRNA PANDAR和Bcl-2對MG-63細胞增殖能力的影響

注：圖A表示轉(zhuǎn)染前，MG-63細胞凋亡情況；圖B表示轉(zhuǎn)染后，MG-63細胞凋亡情況;圖C表示過表達Bcl-2后，MG-63細胞凋亡情況；圖D表示MG-63細胞凋亡率統(tǒng)計值。

2.4阿霉素共培養(yǎng)對不同轉(zhuǎn)染組骨肉瘤細胞的影響 各組于培養(yǎng)基中加入0.1 μmol阿霉素聯(lián)合培養(yǎng)，記錄24 h后生存細胞百分比。抑制lncRNA PANDAR 表達后可抑制骨肉瘤細胞耐藥(P<0.05)，而過表達Bcl-2可拮抗si-lncRNA PANDAR 的作用(P<0.05)；同樣的現(xiàn)象在MG-63/DOX細胞中也得到了驗證，但是在MG-63/DOX細胞中對細胞耐藥的影響不如MG-63細胞明顯(P<0.05)。見圖5。

注：圖A表示阿霉素共培養(yǎng)對不同轉(zhuǎn)染組MG-63細胞的影響；圖B表示阿霉素共培養(yǎng)對不同轉(zhuǎn)染組MG-63/DOX細胞的影響。

3 討 論

化療耐藥是骨肉瘤治療的主要難點之一。阿霉素是標準的一線骨肉瘤化療藥物，一旦發(fā)生耐藥，無有效的二線化療藥物可供選擇。耐藥性的發(fā)展是與一個或多個基因的異常表達和相關(guān)信號通路的激活密切相關(guān)。近年來，許多研究證實lncRNA可通過影響細胞周期、凋亡，調(diào)控耐藥基因或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)各種腫瘤的化療耐藥[6-8]。例如，SI等[6]報道H19可通過抑制激活BIK啟動子，調(diào)控ERα陽性乳腺癌的化療耐藥；CHEN等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1作為致癌基因，通過競爭性內(nèi)源性RNA機制上調(diào)Bcl-xl表達，促進肺腺癌的阿霉素化療耐藥；LI等[8]報道lncRNA HOTTIP通過促進HOXA13表達介導(dǎo)胰腺癌吉西他濱耐藥。因此，研究耐藥細胞與敏感細胞之間lncRNA表達的變化，以及在誘導(dǎo)耐藥過程中l(wèi)ncRNA參與表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制，可能為克服腫瘤化療耐藥提供新的視角和可能的治療方案。

lncRNA PANDAR的功能于2011年由HUNG等[9]首次報道，作為p53依賴的lncRNA，同轉(zhuǎn)錄因子NF-YA相互作用，參與細胞凋亡表型。并且lncRNA PANDAR也在多種惡性腫瘤中過表達。lncRNA PANDAR可通過調(diào)節(jié)p53的磷酸化，參與卵巢癌的鉑類耐藥[10]；lncRNA PANDAR也可通過阻止CDKN1A的轉(zhuǎn)錄，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[11]，同時血清中過表達的lncRNA PANDAR也可能是胃癌的分子診斷標志物；lncRNA PANDAR的過表達可能同結(jié)腸癌和口腔鱗狀細胞癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]；但目前，lncRNA PANDAR在骨肉瘤化療耐藥中的作用相關(guān)報道較少。

化療藥物是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的核心事件之一。內(nèi)源性凋亡主要受Bcl-2家族蛋白調(diào)控。Bcl-2在人濾泡性淋巴瘤中通過染色體易位激活[13-14]，過表達的Bcl-2使抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白表達失衡，抵消了促凋亡蛋白的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PANDAR在骨肉瘤細胞中過表達，抑制lncRNA PANDAR表達后，Bcl-2的表達也隨之下降。同時，在抑制lncRNA PANDAR的表達后，細胞的增殖能力減弱，凋亡增加，在與阿霉素共培養(yǎng)的條件下，細胞活力明顯減弱。而在抑制lncRNA PANDAR表達，同時過表達Bcl-2，骨肉瘤細胞的上述惡性表型部分恢復(fù)。筆者推測，lncRNA PANDAR參與骨肉瘤的耐藥機制可能是通過Bcl-2實現(xiàn)的。

綜上所述，lncRNA PANDAR在骨肉瘤細胞中過表達，通過調(diào)控Bcl-2的表達影響骨肉瘤阿霉素化療耐藥。但其具體分子結(jié)合位點及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，仍需在后續(xù)研究中進一步探討。