邢臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邢臺(tái) 054001

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。2018年的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌占全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的24.2%，占女性惡性腫瘤死亡率的15.0%［1］。在中國(guó)，乳腺癌發(fā)病率也逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA分子被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中miRNA在乳腺癌研究領(lǐng)域中占據(jù)著重要地位。

miRNA是一類長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，其作用機(jī)制主要為靶向于mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’ untranslated region，3’UTR）從而抑制其靶基因的表達(dá)［2］。越來越多的研究［3］證實(shí)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究［4］證實(shí)，miR-26b-3p可靶向于泛素化特異性蛋白酶39（ubiquitin-specific protease 39，USP39），在鼻咽癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，關(guān)于miR-26b-3p在乳腺癌中的研究尚未見報(bào)道，本研究探討miR-26b-3p在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為乳腺癌的防治提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素雙抗混合液購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，Hiperfect Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）Mix購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自美國(guó)MCE公司，雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司，BALB/c裸小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 RTFQ-PCR檢測(cè)miR-26b-3p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

采用RTFQ-PCR檢測(cè)3種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453中miR-26b-3p的表達(dá)水平。使用TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，使用美國(guó)Promega公司反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒制備cDNA模板，并進(jìn)行RTFQ-PCR擴(kuò)增，條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。miR-26b-3p和內(nèi)參基因U6的特異性反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增引物購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-26b-3p的平均相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-26b-3p mimics的轉(zhuǎn)染

陰性對(duì)照（negative control，NC）和miR-26b-3p mimics質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。MDA-MB-453細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1×106個(gè)細(xì)胞/孔種植于6孔板中培養(yǎng)24 h，按照Hiperfect Reagent推薦的轉(zhuǎn)染方法，每孔中分別加入10 μL的miR-26b-3p mimics或NC質(zhì)粒和50 μL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。另將4 μL Hiperfect Reagent加至50 μL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，分別混勻靜置5 min。再將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜置20 min，加至每孔使終體積達(dá)到2 mL。轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育24～48 h。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

MDA-MB-453細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。分別于第0、24、48、72和96 h時(shí)在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕輕搖勻后置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育1～2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞于450 nm處的吸光度（D）值。

1.5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

將低溫融化的Matrigel與無血清RPMI-1640培養(yǎng)液按照1∶7稀釋，混勻后加20 μL到24孔板中，放置在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中過夜凝固。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-453細(xì)胞重懸于200 μL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，按照2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于transwell小室上，在24孔板的每孔中加入800 μL帶胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。注意向24孔板中加Matrigel時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，不加Matrigel時(shí)則檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育48 h后，用4%多聚甲醛溶液固定20 min，然后結(jié)晶紫染色10 min，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)目并拍照。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)邢臺(tái)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。選用4周齡BALB/c裸小鼠，隨機(jī)分為2組（每組5只）。熒光素酶標(biāo)記的MDAMB-453細(xì)胞（Luc-MDA-MB-453）轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics或NC 24 h后分別皮下注射BALB/c裸小鼠（每只裸小鼠注射0.2 mL濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液）建立人乳腺癌細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型，每隔3 d通過皮下注射miR-26b-3p agomir和NC agomir，采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)移植瘤的大小。對(duì)于裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤模型，選用4周齡BALB/c裸小鼠，隨機(jī)分為2組（每組5只）。MDA-MB-453細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics或NC后分別經(jīng)尾靜脈注射裸小鼠（每只裸小鼠注射0.2 mL濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液），每隔3 d通過尾靜脈注射miR-26b-3p agomir和NC agomir，12周后處死，解剖肝組織計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移瘤的結(jié)節(jié)數(shù)目，然后將肝組織固定于4%多聚甲醛溶液中，作H-E染色檢測(cè)病理學(xué)改變。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

將miR-26b-3p mimic和鋅指E盒結(jié)合同源盒基因1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1） 3’UTR野生型（wild-type，WT）或突變型（mutant，MUT）同時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用x±s表示，組間的兩兩比較采用Student’st檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-26b-3p在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)選取3種人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453，采用RTFQ-PCR檢測(cè)這3種細(xì)胞系中miR-26b-3p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453中miR-26b-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.08、4.57±0.28和8.37±0.29（圖1）。其中，MDA-MB-453細(xì)胞中miR-26b-3p的表達(dá)水平最低，因此選用MDA-MB-453細(xì)胞進(jìn)行miR-26b-3p的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-26b-3p在3種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453中的表達(dá)Fig.1 miR-26b-3p expression in three human breast cancer cell lines MCF-7,MDA-MB-231 and MDA-MB-453

2.2 轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中miR-26b-3p表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)利用miR-26b-3p模擬物miR-26b-3p mimics轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453后，通過RTFQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-26b-3p的轉(zhuǎn)染效率。miR-26b-3p mimics轉(zhuǎn)染組的MDA-MB-453細(xì)胞中miR-26b-3p的表達(dá)水平與NC組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1 206.00±23.12vs1.00±0.05，P＜0.05，圖2）。這表明MDAMB-453細(xì)胞中miR-26b-3p過表達(dá)成功。

圖2 RTFQ-PCR檢測(cè)miR-26b-3p mimics轉(zhuǎn)染后MDAMB-453細(xì)胞中miR-26b-3p表達(dá)的變化Fig.2 The expression of miR-26b-3p in MDA-MB-453 cells transfected with miR-26b-3p mimics or NC control was detected by RTFQ-PCR

2.3 miR-26b-3p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖

將miR-26b-3p mimics轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453后，采用CCK-8法檢測(cè)miR-26b-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。在轉(zhuǎn)染72、96 h后，miR-26b-3p過表達(dá)組中MDA-MB-453的增殖能力與NC組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.4 miR-26b-3p抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

采用transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-26b-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453遷移和侵襲能力的影響。轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics組中細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目與NC組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖3 通過CCK-8法檢測(cè)miR-26b-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-453增殖能力的影響Fig.3 The effect of miR-26b-3p on the proliferation of breast cancer cell MDA-MB-453 was measured by CCK-8 assay

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的遷移和侵襲能力Fig.4 The migration and invasion abilities of MDA-MB-453 cells after transfection with miR-26b-3p mimics were detected by transwell migration and invasion assay

2.5 miR-26b-3p抑制乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics后，乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。乳腺癌裸小鼠肝轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26b-3p agomir后，乳腺癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

圖5 小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics后，乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)顯著降低Fig.5 In vivo imaging system results revealed that enforced expression of miR-26b-3p inhibited tumor growth of breast cancer xenografts

圖6 裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics后，乳腺癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移能力顯著下降Fig.6 Liver metastatic model results revealed that enforced expression of miR-26b-3p inhibited breast cancer metastasis

2.6 miR-26b-3p靶向調(diào)控ZEB1

TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZEB1是miR-26b-3p的靶基因之一，其結(jié)合位點(diǎn)見圖7A，雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，miR-26b-3p顯著抑制野生型ZEB1 3’UTR熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)突變型ZEB1 3’UTR熒光素酶活性無影響（圖7B）。RTFQ-PCR和Western檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-26b-3p后顯著下調(diào)MDA-MB-453細(xì)胞中ZEB1基因和蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05，圖7C～D）。結(jié)果表明，ZEB1是miR-26b-3p的直接靶基因，且miR-26b-3p可負(fù)調(diào)控ZEB1的表達(dá)。

圖7 ZEB1是miR-26b-3p的靶基因Fig.7 ZEB1 is a target gene of miR-26b-3p

3 討 論

miRNA是近年來研究較為廣泛的一類非編碼RNA分子，其在真核細(xì)胞內(nèi)普遍存在，其作用機(jī)制主要為靶向于mRNA的3’UTR，從而抑制下游靶基因的表達(dá)［5］。多項(xiàng)研究［6-9］表明，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬及化療耐藥等。然而，關(guān)于miR-26b-3p在腫瘤中的研究還較少，尤其在乳腺癌中的研究尚未見報(bào)道。

本研究采用RTFQ-PCR檢測(cè)了3種乳腺癌細(xì)胞系中miR-26b-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-26b-3p在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453中的表達(dá)水平最低。因此，本研究采用MDA-MB-453轉(zhuǎn)染miR-26b-3p mimics，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-26b-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。本研究結(jié)果表明，miR-26b-3p能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。體內(nèi)裸小鼠移植瘤和轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)表明，miR-26b-3p能夠抑制乳腺癌裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究miR-26b-3p影響乳腺癌功能的分子機(jī)制，本研究采用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-26b-3p的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-26b-3p與ZEB1存在結(jié)合位點(diǎn)。

ZEB1是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其在乳腺癌中廣泛表達(dá)且調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞的增殖、分化、血管生成、化療耐藥、干細(xì)胞活性、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移等［10-16］。ZEB1在細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制目前還未完全闡明，miRNA有可能參與了腫瘤發(fā)展過程中ZEB1的調(diào)控。本研究結(jié)果表明，miR-26b-3p能通過直接結(jié)合ZEB1從而抑制乳腺癌細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究初步闡明了miR-26b-3p作為非編碼RNA在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能及其潛在的分子機(jī)制，為今后進(jìn)行深入研究奠定了必要的基礎(chǔ)。