王 賀, 唐 晁, 齊莉莉,*, 董春楠, 宋兆昱, 任曉鵬

(1.河北醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室, 石家莊 050017; 2.河北醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)學(xué)院, 石家莊 050000)

死后間隔時(shí)間(postmortem interval, PMI)一直是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，而法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)的發(fā)展為PMI的推斷開(kāi)辟了新途徑(胡萃, 2000)。尸食性蠅類是人類尸體腐敗過(guò)程中，最早出現(xiàn)在尸體上的昆蟲(chóng)之一，它們可以在尸體上產(chǎn)卵并孵化成幼蟲(chóng)最后化蛹，這一過(guò)程中，尸體的很多信息會(huì)“記錄”在它們體內(nèi)，通過(guò)研究蠅的各種指標(biāo)找到這些信息從而為偵破案件提供依據(jù)正是法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)家的主要任務(wù)(李學(xué)博等, 2013)。目前，關(guān)于尸食性蠅類的研究多集中在了幼蟲(chóng)期，而蠅蛹往往是案件現(xiàn)場(chǎng)尸體周圍發(fā)現(xiàn)率最高的蟲(chóng)態(tài)之一(馬孟云等, 2016)，因此，蛹期的研究至關(guān)重要。

蠅蛹的蛹?xì)ゎ伾曰己蟪尸F(xiàn)規(guī)律性變化，可作為蠅蛹日齡的良好指標(biāo)(Greenberg, 1985)，因此，利用蛹?xì)ゎ伾兓茰y(cè)死亡時(shí)間將是一種簡(jiǎn)便易行的辦法。國(guó)內(nèi)關(guān)于案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)尸食性蠅類蛹期的發(fā)育形態(tài)研究不少(王江峰等, 2002)，而蛹?xì)ゎ伾兓难芯坎欢?。本研究旨在探尋一種將蛹?xì)ゎ伾兓唧w量化從而更加準(zhǔn)確地反映蛹期發(fā)育時(shí)間的方法，為PMI的推斷提供新思路。絲光綠蠅Luciliasericata是最常見(jiàn)的尸食性蠅類之一，也是石家莊市優(yōu)勢(shì)蠅種，對(duì)其蛹期的深入研究可為石家莊市蠅類研究和在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用積累資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與飼養(yǎng)

在位于石家莊長(zhǎng)安區(qū)的河北醫(yī)科大學(xué)校園內(nèi)以大鼠內(nèi)臟誘捕成蠅，帶回實(shí)驗(yàn)室，按照《中國(guó)蠅類檢索表》(范滋德, 1997)系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分類，選取絲光綠蠅放入養(yǎng)蠅籠內(nèi)，置于MGC-300B型智能光照培養(yǎng)箱(溫度28℃，相對(duì)濕度50%～60%，光周期為12L∶12D)內(nèi)飼以清水、奶粉與糖混合物(1∶1, m/m)，并兩天更換一次，以保持干凈新鮮。飼養(yǎng)至第3代作為實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)源。

用豬肉誘蠅產(chǎn)卵分別置于16, 20, 24, 28和32℃的培養(yǎng)箱(MGC-300B型)內(nèi)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)直至其化蛹，隨機(jī)選取10頭蛹移至盛有2/3細(xì)沙的90 mm滅菌培養(yǎng)皿中，兩蛹之間間隔≥15 mm，各蛹朝向角度一致，保持細(xì)沙濕度。

1.2 提取蛹?xì)ゎ伾珨?shù)據(jù)

自化蛹起每間隔12 h，取出蠅蛹進(jìn)行觀察拍照。拍照環(huán)境為：室內(nèi)自然光線，距工作臺(tái)上方垂直500 mm高度處放置LED補(bǔ)光燈。用軟毛刷輕掃蛹體后用鑷子輕輕逐個(gè)夾取蠅蛹至體視顯微鏡(OLYMPUS-SZ61)的載物臺(tái)上，依次拍照，分別留取不同恒溫下的蛹?xì)ゎ伾珗D片。拍照完的蠅蛹再次放回培養(yǎng)皿中，置回原培養(yǎng)箱，待12 h后重復(fù)上述步驟直至羽化。將圖片導(dǎo)入圖像分析系統(tǒng)中，做圖片預(yù)處理后，在窗口下選擇“顏色”選擇框，利用“顏色取樣器”(顏色取樣器選項(xiàng)欄中的取樣大小設(shè)定為5×5，即一次讀取5×5像素區(qū)域的平均值)隨機(jī)在蛹?xì)ど线x取50個(gè)像素點(diǎn)，讀取顏色數(shù)據(jù)，分別記錄顏色板中的RGB值，取各自均值作為該恒溫下每間隔12 h的絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾臉?biāo)準(zhǔn)RGB值。

1.3 制作色板和回歸分析

將不同恒溫下蛹?xì)ゎ伾S發(fā)育時(shí)間變化的標(biāo)準(zhǔn)RGB值導(dǎo)入圖像分析軟件中，使用“顏色板”工具，制作與發(fā)育時(shí)間一一對(duì)應(yīng)的蛹?xì)ゎ伾珮?biāo)準(zhǔn)色塊，并將色塊保存至各溫度下的文件夾。在Word文檔中打開(kāi)各色塊文件，調(diào)整至相同大小，按發(fā)育時(shí)間排列，制作各恒溫下的蛹?xì)ゎ伾珮?biāo)準(zhǔn)色板。采用R軟件對(duì)蛹發(fā)育時(shí)間與蛹?xì)ゎ伾玆GB值中的R值的關(guān)系進(jìn)行多元回歸分析和擬合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究測(cè)得數(shù)據(jù)的處理使用Excel軟件和R軟件(ver.3.6.3)，圖片處理使用Adobe Photoshop cc2017和Motic Image Advanced 3.2軟件。

2 結(jié)果

2.1 絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾兓?guī)律

在不同恒溫條件下，絲光綠蠅的蛹?xì)ゎ伾S發(fā)育時(shí)間總體呈逐漸加深趨勢(shì)，但此變化不均勻，開(kāi)始為淺白黃色或淡黃色，很快變?yōu)辄S褐色至紅褐色，紅褐色蛹?xì)ふ紦?jù)蛹期大部分時(shí)間，直到臨近羽化，由于透過(guò)蛹?xì)た煽吹絻?nèi)部蛹體組織，此時(shí)的蛹已全身布滿黑褐色鬃毛，所以蛹?xì)ゎ伾冎磷钌畛屎诤稚?。可?jiàn)，蛹?xì)ゎ伾诨汲跗诤团R近羽化時(shí)變化較大，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，蛹的發(fā)育歷期越短，蛹?xì)ゎ伾兓厔?shì)也越快(圖1)。

圖1 不同恒溫下絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾珮?biāo)準(zhǔn)色板

2.2 蛹?xì)ゎ伾玆GB值的變化

各恒溫下蛹?xì)ゎ伾腞GB值(表1)隨發(fā)育時(shí)間均呈下降趨勢(shì)，尤其在化蛹初期及臨近羽化時(shí)更明顯；RGB值的變化幅度也有差異，其中R變化最明顯，是蛹?xì)ゎ伾兓闹鲗?dǎo)，而B(niǎo)變化最平緩，大致呈減低趨勢(shì)。隨溫度升高，蛹?xì)GB值的變化歷期越短。采用R軟件進(jìn)行多元回歸分析和擬合，結(jié)果RGB值中以R值與時(shí)間的擬合度最佳，建立的多項(xiàng)式回歸方程為:x=β0+β1y+β2y2+β3y3，其中y為發(fā)育時(shí)間(h)，x即該發(fā)育時(shí)間對(duì)應(yīng)的蛹?xì)ゎ伾玆GB值中的R值。各溫度下三次函數(shù)擬合效果均佳，經(jīng)方差分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 不同恒溫下絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾玆GB值中的R值與發(fā)育時(shí)間的擬合方程

2.3 蛹?xì)ゎ伾臉?biāo)準(zhǔn)色板

根據(jù)RGB值(表1)，利用圖像處理軟件得到不同恒溫下絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾臉?biāo)準(zhǔn)色板(圖1)。

表1 不同恒溫下絲光綠蠅蛹?xì)ゎ伾腞GB值

由RGB值和繪制的標(biāo)準(zhǔn)色板可得出：在不同恒溫、其余生存條件相同的條件下，絲光綠蠅蛹?xì)さ臉?biāo)準(zhǔn)色板由淡黃色漸至紅褐色直至黑褐色，這一變化是連續(xù)但不均勻的，紅褐色色板占據(jù)蛹期大部分時(shí)間；溫度越高，色板數(shù)量越少，表明蛹發(fā)育歷期越短，溫度越低，色板數(shù)量多，發(fā)育歷期越長(zhǎng)。RGB值隨時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)值越低，導(dǎo)致蛹?xì)ど逶桨怠?/p>

3 討論

近年來(lái)，法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)發(fā)展迅速，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)尸食性蠅類的蛹期形態(tài)發(fā)育進(jìn)行過(guò)研究，Greenberg曾提出根據(jù)蛹?xì)ゎ伾兓倪^(guò)程，建立一個(gè)顏色與化蛹后時(shí)間一一對(duì)應(yīng)的色板，再以待檢蛹?xì)づc標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，即可得出蠅蛹日齡的想法(Greenberg, 1995)，但未見(jiàn)后續(xù)。國(guó)內(nèi)Ma等(2015)對(duì)大頭金蠅Chrysomyamegacephala、巨尾阿麗蠅Aldrichinagrahami等蠅蛹的發(fā)育形態(tài)做了詳細(xì)研究，積累了寶貴資料，同時(shí)也觀察到化蛹后蛹?xì)ゎ伾傻S色至紅褐色，之后逐漸加深的現(xiàn)象，并提出根據(jù)蛹?xì)さ念伾蛇M(jìn)一步更準(zhǔn)確地推斷死亡時(shí)間。筆者一直致力于尸食性蠅蛹蛹期的發(fā)育形態(tài)學(xué)研究，對(duì)蛹?xì)ゎ伾沧隽诵┏跆叫栽囼?yàn)研究，發(fā)現(xiàn)記錄蛹?xì)さ念伾兓傻玫接袃r(jià)值的時(shí)間證據(jù)(王賀, 2007)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究將蛹?xì)さ念伾兓瘶?biāo)準(zhǔn)化的方法，通過(guò)試驗(yàn)方法的改進(jìn)更準(zhǔn)確地捕捉蛹?xì)ゎ伾兓男畔?shù)據(jù)，以增強(qiáng)此法實(shí)際應(yīng)用的可靠性。

首先，蛹?xì)?biāo)本的選取方法。通常的蠅蛹發(fā)育學(xué)研究都是按一定的時(shí)間間隔定期留取標(biāo)本，這種方法存在蛹發(fā)育不同步的問(wèn)題，樣本量足夠大的情況下，可以忽略。但以往的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)留取大量標(biāo)本很難實(shí)現(xiàn)，尤其在發(fā)育歷期較長(zhǎng)的溫度下。此次實(shí)驗(yàn)我們改變采集標(biāo)本方法，即開(kāi)始化蛹時(shí)選取10頭發(fā)育基本同步的蛹，對(duì)其定期持續(xù)觀察，即以活蛹為標(biāo)本采集顏色信息。此法需要注意每次取蛹動(dòng)作輕柔，以保證其存活至羽化。以后的實(shí)驗(yàn)可以增加標(biāo)本量，使獲得的RGB值更準(zhǔn)確。

其次，蛹?xì)GB值的影響因素。本實(shí)驗(yàn)利用圖像分析軟件對(duì)不同發(fā)育階段的蛹?xì)るS機(jī)選取像素點(diǎn)，提取各個(gè)像素點(diǎn)的RGB值，分別取均值作為該溫度該發(fā)育時(shí)間的蛹?xì)ゎ伾臉?biāo)準(zhǔn)RGB值，像素點(diǎn)的選擇區(qū)域由最初的胸背局部范圍擴(kuò)大到全蛹，像素點(diǎn)數(shù)量也增多至50個(gè)，蛹體顏色是一個(gè)成千上萬(wàn)RGB混合而成的復(fù)合顏色，像素點(diǎn)的樣本量越大，色板才能越真實(shí)地反映蛹?xì)ゎ伾?。通常情況下，RGB各有256級(jí)亮度，用數(shù)字表示為從0, 1, 2, …, 255，因此RGB組成有千萬(wàn)種，用其表示色彩是相當(dāng)靈敏的，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格要求，以盡量減少采集圖像、讀取RGB值過(guò)程中的偏差，保證標(biāo)準(zhǔn)色卡的使用可靠性：(1)拍照環(huán)境的光照強(qiáng)度保持恒定。我們采用工作臺(tái)設(shè)置補(bǔ)光燈的方法，補(bǔ)光燈參數(shù)為20～30 W，色溫為3 200～5 000 K，顯色指數(shù)Ra≥95，距桌面垂直高度500 mm左右，以盡量減少環(huán)境光線變化對(duì)圖片色彩的影響。(2)應(yīng)用圖像分析軟件采集圖片和讀取RGB值時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行白平衡校對(duì)，并將所有圖片的色階、對(duì)比度、色調(diào)等以參照卡[圖像軟件中RGB配色表分量均為190的灰色(Grey)色卡]為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正。我們建議，標(biāo)準(zhǔn)色板可用于初篩，將待檢蛹與色板進(jìn)行目視比色，粗略估算蛹期，要精確推斷日齡，可按上述試驗(yàn)方法提取待檢蛹?xì)さ腞GB值，參考各溫度下R值的曲線擬合方程，可獲得發(fā)育時(shí)間，同時(shí)可結(jié)合蛹內(nèi)形態(tài)發(fā)育或其他生理生化指標(biāo)(鄭娜等, 2016)。近幾年很多學(xué)者不斷嘗試，如利用影像診斷技術(shù)CT等來(lái)觀察蛹內(nèi)部發(fā)育以推斷蛹期(Hall, 2017)，為蛹期發(fā)育研究開(kāi)辟了新思路。

本實(shí)驗(yàn)觀察到紅褐色蛹?xì)ご嬖跁r(shí)間較長(zhǎng)，我們?cè)吡υ噲D將紅褐色階段再分，但由于此階段顏色變化視覺(jué)差甚小，肉眼難以區(qū)別，這與Greenberg(1995)的蛹?xì)陌咨郊t褐色的轉(zhuǎn)變可提供前10個(gè)多小時(shí)的顏色標(biāo)志的結(jié)論相似?？梢?jiàn)，利用蛹?xì)ゎ伾茢嘤计诘姆椒ㄔ诨汲跗诤团R近羽化階段意義較大，但這兩個(gè)階段蠅蛹的變化異常迅速，難以捕捉，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可重點(diǎn)集中在此，持續(xù)觀察爭(zhēng)取采集到有意義的時(shí)間信息。實(shí)際案例中，蛹?xì)ゎ伾兓艿皆S多外界因素影響，而案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的溫度對(duì)于蛹期的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響(Michaudetal., 2012)。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同恒溫的基礎(chǔ)條件來(lái)為實(shí)際案例中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)色板提供可參考的依據(jù)。有關(guān)實(shí)際情況下環(huán)境光照、濕度等因素對(duì)蛹期發(fā)育的影響等問(wèn)題有待進(jìn)一步研究(楊帆等, 2015)。本實(shí)驗(yàn)表明蠅蛹的顏色變化可作為比較直觀的判斷依據(jù)。利用蛹?xì)ゎ伾茢嘤计冢恍枰獜?fù)雜的專業(yè)知識(shí)，操作技能和高端的儀器設(shè)備，簡(jiǎn)便實(shí)用，將待檢蛹?xì)づc本研究得到的標(biāo)準(zhǔn)色板進(jìn)行目視比色，可粗略快速推測(cè)蠅蛹發(fā)育時(shí)間，為死后間隔時(shí)間的推斷提供較科學(xué)的依據(jù)，具有一定實(shí)用價(jià)值。