楊付來, 趙真真, 王月華, 張 蘭, 張燕寧, 毛連綱, 蔣紅云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 北京 100193)

甜菜夜蛾Spodopteraexigua隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，在世界范圍內(nèi)均有分布，可取食130余種農(nóng)作物和蔬菜，食源性廣、繁殖能力強、具有很強的抗逆能力和成蟲遷飛能力，是極難防治的害蟲之一(Sunetal., 2015)。因此，研發(fā)以甜菜夜蛾蛋白酶為特異殺蟲藥劑作用靶標(biāo)的環(huán)境和諧性農(nóng)藥對于有效控制該蟲為害具有重要意義。

谷氧還蛋白(glutaredoxin, Grx)是生物體內(nèi)依賴硫醇的抗氧化酶，因為依賴谷胱甘肽才能還原核苷酸還原酶的二硫鍵被鑒定出來(M?ssneretal., 1998)，廣泛存在于各種生物體內(nèi)且功能高度保守(Holmgren, 1976)。Grx通過可逆性谷胱甘肽化修飾蛋白質(zhì)上特定的氨基酸殘基調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，維持和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)及相關(guān)的信號途徑，參與生物體內(nèi)電子傳遞以及鐵代謝等重要生理活動，在生物氧化脅迫、細(xì)胞調(diào)亡等許多重要的生命活動中發(fā)揮作用，目前是國內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病治療靶蛋白的研究熱點。至今為止，在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae中共發(fā)現(xiàn)8個Grxs，以數(shù)字分別命名為Grx1-8(Abdallaetal., 2018)。通過χ射線晶體學(xué)和核磁共振光譜方法解析其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Grx1具有典型的CPYC雙巰基活性位點，只有一個谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，N端無信號肽結(jié)構(gòu)，主要由5個α螺旋包圍4個β折疊組成(Coppoetal., 2019; Sousaetal., 2019)。其中研究發(fā)現(xiàn)Grx1對氧化劑高度敏感，特異性地催化還原特定的靶標(biāo)蛋白質(zhì)，具有保護細(xì)胞、抗氧化的重要功能(Yeetal., 2014; Mantaetal., 2019)。如哺乳動物細(xì)胞毒性試驗表明, Grx1可以用來降解除草劑2,4-二氯苯氧基乙酸的毒性，產(chǎn)生羥基自由基，防止2,4-二氯苯氧基乙酸的危害(Liuetal., 2013)。在人類及哺乳動物模型中，Grx1作為細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)勢的重要調(diào)節(jié)蛋白功能已經(jīng)得到一定明確，并發(fā)現(xiàn)其對人類重大疾病如阿爾茨海默病，血色素沉著病、帕金森病和癌癥具有調(diào)控功能(Sabensetal., 2010; Levinetal., 2018; Lietal., 2018; Brancoetal., 2020)。隨著蛋白修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面研究的深入，結(jié)合各種技術(shù)挖掘Grx1對細(xì)胞氧化還原態(tài)勢調(diào)節(jié)作用及機理，對于深刻認(rèn)識 Grx1對人類疾病的調(diào)控以及藥物開發(fā)都十分重要。

國內(nèi)外關(guān)于昆蟲Grx的研究較少，僅有幾種昆蟲的Grx基因被分類鑒定，并初步研究了其在氧化脅迫中的抗氧化功能(Lietal., 2018)。在模式昆蟲黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中有報道人類Grx1直系同源基因CG6852在果蠅血液重金屬銅平衡中具有重要的調(diào)節(jié)作用(Mercer and Burke, 2016)。在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中，共有3個Grx基因(HaGrx,HaGrx3和HaGrx5)被鑒定，當(dāng)棉鈴蟲受到非正常溫度脅迫和H2O2處理時，HaGrx,HaGrx3和HaGrx5表達量發(fā)生改變，作者推測其在棉鈴蟲保護組織免受氧化脅迫損傷中發(fā)揮重要作用(Zhangetal., 2016)。但這些研究中，關(guān)于昆蟲Grx基礎(chǔ)生物學(xué)特性及抗氧化機制并沒有得到系統(tǒng)深入的研究。

本研究中，利用本課題組前期已經(jīng)獲得甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆甜菜夜蛾谷氧還蛋白1基因SeGrx1，構(gòu)建原核蛋白表達系統(tǒng)，純化SeGrx1蛋白，并測定SeGrx1蛋白酶活性和催化動力學(xué)參數(shù)，以期為明確谷氧還蛋白在昆蟲氧化脅迫及凋亡等生命活動中的作用機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲細(xì)胞

甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ，由中國科學(xué)院動物研究所提供(Zhangetal., 2012)。細(xì)胞培養(yǎng)于Grace昆蟲培養(yǎng)基(10%胎牛血清，Invitrogen, CA, 美國)，其培養(yǎng)條件為26±1℃，RH 70%～80%，每6 d傳代1次。

1.2 實驗材料

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21(E3)菌株,購自天根生化(北京)有限公司;原核表達載體(pET-16b)和基因克隆載體(pGEM-T Easy Vector System),購自Promega公司;RACE試劑盒(SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit)、DNA聚合酶(Ex Taq?)、DNA Marker(DL1000和DL2000),購自TaKaRa公司;HindⅢ,XhoⅠ內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶,購自New England Biolabs公司;RNA提取試劑盒(RNeasy?Mini Kit),購自QIAGEN公司;DNA純化提取試劑盒(EasyPure? Quick Gel Extraction Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix),購自全式金公司;鎳-瓊脂糖凝膠 HP和分子篩(Superdex75和Superdex200),購自GE Healthcare公司;熒光谷氧還蛋白分析試劑盒(Fluorescent Glutaredoxin Assay Kit 96 Well),IMCO Corporation Ltd AB公司產(chǎn)品;異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等常用分子和生化試劑,均購自北京博奧拓達科技有限公司。

1.3 甜菜夜蛾SeGrx1基因序列克隆

分別按照RNA提取試劑盒(RNeasy?Mini Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)說明書方法進行甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ總RNA提取和cDNA合成。根據(jù)本課題組前期已獲得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Premier 6.0軟件和RACE試劑盒說明書分別設(shè)計特異性引物和RACE擴增引物(表1)，RACE試劑盒(SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit)和DNA聚合酶(Ex Taq?)進行PCR和RACE擴增。針對獲得的SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列，使用DNAMAN軟件進行拼接，獲得甜菜夜蛾SeGrx1基因全長。通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Open Reading Frame Finder預(yù)測開放閱讀框(ORF)，并設(shè)計特異性引物進行ORF擴增(Ex Taq?)，PCR產(chǎn)物純化后連接至pGEM-T Easy Vector System載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進行PCR檢測并送公司進行測序。

表1 引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析

將獲得的SeGrx1基因利用DNAMAN 翻譯的相應(yīng)氨基酸序列進行分子量大小和等電點以及多序列對比，通過NCBI Conserved Domains Search在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)家族和活性位點(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Phyre2在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.5 SeGrx1原核表達

將克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-SeGrx1和原核表達載體pET-16b分別進行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后純化回收目的產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(E3)，涂布含氨芐青霉素(Amp)的固體LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，進行菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。將陽性克隆接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時加入IPTG至其終濃度為0.4～1.0 mmol/L, 25～37℃ 220 r/min誘導(dǎo)4～8 h。離心收集重組菌體后，SDS-PAGE檢測蛋白表達，確定最佳誘導(dǎo)表達條件為IPTG終濃度0.5 mmol/L，30℃，220 r/min誘導(dǎo)4 h。

1.6 SeGrx1融合蛋白純化

按照1.5節(jié)獲得的最佳誘導(dǎo)表達條件將陽性克隆菌株大量誘導(dǎo)表達后，收獲菌體，冰中超聲破碎后離心收集上清與提前平衡好的Ni柱相結(jié)合，用含0, 20, 50和100 mmol/L咪唑的平衡液洗脫雜蛋白，用含200, 300和500 mmol/L咪唑的平衡液來梯度洗脫目的融合蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。合并純化融合蛋白樣品，TEV酶切除標(biāo)簽，TEV酶切His標(biāo)簽蛋白與TEV酶質(zhì)量比分別為4∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶1.25, 1∶2.5和1∶5進行酶切比例篩選。然后，將含有融合蛋白的洗脫液，在含有0.5 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的反應(yīng)體系中按照質(zhì)量比為2∶5(融合蛋白∶TEV)加入TEV酶，30℃酶切2 h切除融合蛋白HIS標(biāo)簽。用超濾管濃縮除鹽除氣，Superdex 75/200分子篩進一步純化SeGrx1蛋白，純化蛋白進行Western blot驗證，其中SeGrx1多克隆抗體為山東濟南安博特生物科技有限公司制備。

1.7 酶活性及酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定

按照試劑盒說明書進行谷氧還蛋白比活力及酶動力學(xué)參數(shù)測定。酶促反應(yīng)體系(100 μL):反應(yīng)緩沖液10 μL, β-NADPH 0.5 μL, GSH 50 mmol/L, 酵母谷胱甘肽還原酶10 nmol/L, 酶液樣品50 μL。在標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)條件下，使用全波長多功能酶標(biāo)儀記錄反應(yīng)液30 min在520 nm激發(fā)光下的545 nm發(fā)射光值。以人類谷氧還蛋白酶1(hGrx1)標(biāo)準(zhǔn)品測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算SeGrx1比活力。酶動力學(xué)測定時，熒光底物酵母谷胱甘肽還原酶濃度設(shè)置為100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12和1.56 nmol/L。實驗設(shè)3次重復(fù)，采用雙倒數(shù)作圖法計算Vmax和Km。

2 結(jié)果

2.1 甜菜夜蛾SeGrx1基因克隆與生物信息學(xué)分析

通過對甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的甜菜夜蛾Grx1基因片段進行克隆，獲得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全長為738 bp(GenBank登錄號: MK318813)，其中5′非編碼區(qū)長40 bp，3′非編碼區(qū)長347 bp，開放閱讀框(ORF)全長為351 bp(圖1)，編碼116個氨基酸。預(yù)測蛋白分子質(zhì)量為12.57 kD，等電點(pI)為8.45，不含信號肽序列。

圖1 甜菜夜蛾SeGrx1基因序列擴增

NCBI Blast數(shù)據(jù)顯示獲得的甜菜夜蛾谷氧還蛋白氨基酸序列隸屬于人類GRX human class 1 and 2(h_1_2)-like亞家族，與釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeGrx1和Grx2氨基酸序列一致性分別為33.06%和31.47%，但是釀酒酵母Grx2在N端含有信號肽序列。因此，我們確認(rèn)本研究中獲得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶為Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyxmori, 棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和斜紋夜蛾Spodopteralitura的同源氨基酸序列進行多重比對，與家蠶BmGrx1同源性最高，序列一致性為81.03%，與斜紋夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低，為67.80%。它們都具有5個α螺旋4個β折疊等保守序列，含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點特征殘基，CPYC為雙巰基活性位點，且只有這一個谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，為雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。

圖2 4種昆蟲Grx1蛋白氨基酸序列比對

利用Phyre2在線工具預(yù)測甜菜夜蛾SeGrx1蛋白的三維結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1在數(shù)據(jù)庫中與人類Grx2氨基酸序列覆蓋度為93%，一致性為40%，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可信度100%。預(yù)測結(jié)果為SeGrx1中心由4個平行的和反向平行的β折疊混合組成，外圍被5個α螺旋包圍。

2.2 SeGrx1系統(tǒng)發(fā)育和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

應(yīng)用MEGA7.0中的鄰接法，對甜菜夜蛾SeGrx1和其他11種昆蟲的Grx1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。如圖所示，臍橙螟蛾Amyeloistransitella和叢林斜眼褐蝶BicyclusanynanaGrxs聚為一個分支，同時又和甜菜夜蛾SeGrx1聚為同一分支，表明這3個物種在進化上距離較近。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的甜菜夜蛾SeGrx1與其他11種昆蟲Grx1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

利用DNAMAN翻譯的相應(yīng)氨基酸序列，輸入到STRING在線工具，預(yù)測蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。因昆蟲谷氧還蛋白研究本身較少，在選擇分類時，我們選擇人類基因組進行，輸入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列，bit score最高的是人類谷氧還蛋白2(GLRX2)，與2.1節(jié)中三維結(jié)構(gòu)預(yù)測選擇人類谷氧還蛋白2作為模板相一致。因此，以人類谷氧還蛋白2作為模板進行相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明與目標(biāo)蛋白人類谷氧還蛋白2存在已知、預(yù)測或其他相互作用關(guān)系的蛋白有硫氧還蛋白(TXN)，谷氧還蛋白酶3和5(GLR3和GLR5)，谷胱甘肽還原酶(GSR)，磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)，硫氧化還蛋白2(TXN2)，過氧化氫酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，以及過氧化物還原酶3和6(PRDX3和PRDX6)，這些蛋白的主要功能具有相似性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而參與多種細(xì)胞生理過程，表明SeGrx2在保護昆蟲組織免受氧化脅迫損傷中可能發(fā)揮重要作用。

2.3 重組質(zhì)粒pET-16b-SeGrx1構(gòu)建及原核表達

圖4所示，相比空載體，攜帶重組質(zhì)粒pET-16b-SeGrx1菌株在OD值為0.6, 0.8和1.0時經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，裂解液上清中呈現(xiàn)明顯多出蛋白條帶，大小約為16 kD，與預(yù)期重組蛋白大小相符合，且當(dāng)菌液OD600=0.6時，誘導(dǎo)表達目的蛋白條帶相對OD值為0.8和1.0時較為明顯，且在上清液總蛋白含量比率較高。因此，誘導(dǎo)表達條件為當(dāng)菌液OD600=0.6時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG在30℃下誘導(dǎo)4 h。

圖4 甜菜夜蛾SeGrx1融合蛋白的誘導(dǎo)表達

2.4 融合蛋白純化及驗證

SDS-PAGE結(jié)果(圖5)顯示，含有目的融合蛋白的上清液過Ni-TNA柱后，目的融合蛋白能夠有效掛柱，用含有0, 20和50 mmol/L咪唑的洗脫液能夠洗脫雜蛋白，而含有200和300 mmol/L咪唑的洗脫液能夠洗脫目的融合蛋白，融合蛋白條帶清晰，分子量大小約16 kD左右，與預(yù)測目標(biāo)蛋白大小一致。因此，融合蛋白純化條件為先用含有0, 20和50 mmol/L咪唑洗脫液能夠洗脫雜蛋白，而后用含有200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的融合蛋白。

圖5 SDS-PAGE檢測純化的His-SeGrx1融合蛋白

圖6(A)顯示切除His標(biāo)簽后的目的蛋白分子量大小在13 kD左右。用Superdex 75/200分子篩進一步純化目的蛋白。純化樣品SDS-PAGE電泳檢測(圖6: A, 泳道8和9)及Western blot驗證純化搜集的蛋白就是SeGrx1，同時目的蛋白純度可達95%以上(圖6: B)。

圖6 His-SeGrx1融合蛋白His標(biāo)簽切除與純化的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)驗證

2.5 SeGrx1蛋白的酶活力和酶動力學(xué)常數(shù)

根據(jù)試劑盒說明書測定純化SeGrx1酶比活力和動力學(xué)常數(shù)，用人類谷氧還蛋白1(hGrx1)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出SeGrx1酶比活力為0.577 U/mg pro(根據(jù)試劑盒說明，1 U定義為在20℃，pH 7.5條件下，1 nmol/L hGrx1對熒光底物酵母谷胱甘肽還原酶的催化能力)(圖7: A)。通過建立的雙倒數(shù)曲線，得到動力學(xué)常數(shù)最大反應(yīng)速度Vmax為20.5 U/mg pro，米氏常數(shù)Km為14.3 nmol/L(圖7: B)。

圖7 SeGrx1蛋白酶活力和酶動力學(xué)常數(shù)

3 討論

本研究以甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆了SeGrx1基因全長(GenBank登錄號: MK318813)，開放閱讀框(ORF)長351 bp，編碼116個氨基酸。在結(jié)構(gòu)上，SeGrx1蛋白中心含有4個平行和反向平行的β折疊，外圍被5個α螺旋包圍，含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點特征殘基，CXXC為雙巰基活性位點，即SeGrx1屬于雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。雙巰基谷氧還蛋白在生物體內(nèi)有多種功能，通常都是通過CXXC催化位點催化可逆的二硫鍵還原和氧化反應(yīng)來執(zhí)行(Foloppe and Nilsson, 2007)。這些預(yù)測結(jié)果表明, SeGrx1的結(jié)構(gòu)與其他已知谷氧還蛋白在結(jié)構(gòu)上明顯相似，具有典型的谷氧還蛋白折疊。同時催化位點和GSH結(jié)合口袋氨基酸的保守性也表明SeGrx1具有典型的谷氧還蛋白酶活性功能。

為了進一步探究谷氧還蛋白的基礎(chǔ)生物學(xué)特性，我們構(gòu)建了pET-16b-SeGrx1蛋白表達質(zhì)粒。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，在250 r/min培養(yǎng)大腸桿菌至OD600為0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)融合蛋白表達(圖4)?？扇苄許eGrx1-6 His融合蛋白被Ni-TNA柱吸附結(jié)合后，通過優(yōu)化洗脫條件，融合蛋白條帶清晰，分子量大小為16 kD左右，切除標(biāo)簽后的目的蛋白大小在13 kD左右(圖5)，和理論SeGrx1蛋白的分子量12.57 kD相符。經(jīng)過Superdex 75/200分子篩進一步純化目的蛋白，可以得到基本無雜蛋白、純度在95%以上的目的蛋白，其狀態(tài)均一，折疊良好，Western blot進一步驗證收集的目的蛋白就是SeGrx1(圖6)。谷氧還蛋白催化的氧化還原反應(yīng)主要是通過Grx中的半胱氨酸(C)基團催化GSH的巰基(-SH-)與二硫鍵(-S-S-)的交換反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氧化與還原態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡(Galloglvetal., 2008, 2009)。體外測定了甜菜夜蛾SeGrx1對GSH依賴的還原酶的氧化能力，SeGrx1酶比活力為0.577 U/mg pro，最大反應(yīng)速度Vmax為20.5 U/mg pro，米氏常數(shù)Km為14.3 nmol/L(圖7)。

本研究克隆了甜菜夜蛾谷氧還蛋白基因SeGrx1，在通過不斷優(yōu)化誘導(dǎo)和純化條件獲得了高純度和高活性的SeGrx1蛋白，并發(fā)現(xiàn)酶活性和催化活性都比較高，為深入研究谷氧還蛋白在昆蟲氧化脅迫及凋亡等生命活動中的功能提供了理論基礎(chǔ)。