韓寶珠, 車林茸, 陳曉潔, 閆振天, 喬 梁, 陳 斌

(重慶師范大學(xué)昆蟲與分子生物學(xué)研究所, 媒介昆蟲重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

細(xì)胞色素P450是一類含有血紅素結(jié)構(gòu)的超基因家族的末端氧化酶，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，還原態(tài)的該蛋白酶與CO結(jié)合，利用紫外分光光譜檢測，其在450 nm處具有最大吸收峰值。昆蟲細(xì)胞色素P450通常包含5個(gè)保守基序：螺旋C(WxxxR)、螺旋I(GxE/DTT/S)、螺旋K(ExLR)、PERF區(qū)(PxxFxPE/DRE)和血紅素結(jié)合區(qū)(PFxxGxRxCxG/A)(Crooksetal., 2004)。細(xì)胞色素P450廣泛存在于生物體中，能夠催化至少60多種化學(xué)反應(yīng)，參與多種內(nèi)源性化合物(類固醇激素、血脂等)的合成代謝和外源性化合物(藥物、農(nóng)藥、天然產(chǎn)物等)的代謝解毒(Fuchsetal., 1994; Harrisonetal., 2001; Feyereisen, 2012)。其中，CYP6家族被認(rèn)為能夠代謝外源化合物和植物毒素(Feyereisen, 1999)。已有研究表明CYP6家族與殺蟲劑的抗性有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜TriboliumcastaneumQTC279品系腦中特異高表達(dá)的TcCYP6BQ9基因是其對溴氰菊酯高度抗性的分子基礎(chǔ)(Zhuetal., 2010)；AmCYP6AA2在耐溴氰菊酯的矮小瘧蚊Anophelesminimus中的表達(dá)與對溴氰菊酯的抗性的發(fā)展密切相關(guān)(Rongnoparutetal., 2003)；AgCYP6P3和AgCYP6M2被證實(shí)與岡比亞按蚊Anophelesgambiae耐擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性緊密關(guān)聯(lián)(Matowoetal., 2014)。

中華按蚊Anophelessinensis是我國及東南亞地區(qū)重要的傳瘧媒介(Changetal., 2014)。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，通過基因組鑒定和比較轉(zhuǎn)錄組差異分析，篩選出16個(gè)可能與溴氰菊酯抗性相關(guān)的P450基因，其中9個(gè)基因?qū)儆贑YP6亞家族(Yanetal., 2016)。在本研究之前，還沒有關(guān)于中華按蚊P450基因參與擬除蟲菊酯抗性的直接功能例證的報(bào)道。

本研究以中華按蚊為研究對象，結(jié)合前期的研究基礎(chǔ)，從溴氰菊酯抗性品系(YN-LR)的表達(dá)譜中篩選出細(xì)胞色素P450基因AsCYP6Z2，通過對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析、分子克隆、時(shí)空表達(dá)模式分析、誘導(dǎo)表達(dá)檢測、RNAi干擾及分子對接等研究手段，初步證實(shí)了AsCYP6Z2基因與中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的耐受性相關(guān)，這對于進(jìn)一步探討其表達(dá)調(diào)控和在溴氰菊酯代謝機(jī)制方面的研究奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲

實(shí)驗(yàn)室敏感品系(WX-LS)為多世代自交系?？剐云废?YN-LR)是以采集自云南元陽的抗性個(gè)體作為供體親本，并與實(shí)驗(yàn)室敏感品系進(jìn)行多世代(不少于10代)回交而構(gòu)建的近等位基因系。抗性品系的篩選檢測方法是將羽化3 d的雌蚊移入WHO接觸桶(含0.05%溴氰菊酯)中，60 min后將接觸桶蚊蟲移到恢復(fù)筒中，統(tǒng)計(jì)死亡率(World Health Organization, 2016)?？垢衅废稻谑覂?nèi)同樣條件(27℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D)下飼養(yǎng)，每天給幼蟲和蛹換兩次清水和魚苗食物，用10%葡萄糖溶液飼養(yǎng)成蟲。

1.2 主要試劑與耗材

DNA片段擴(kuò)增所使用的TransStart? FastPfu Fly DNA Polymerase購自北京全式金公司；DNA片段純化使用的E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；RNA提取使用的高純度總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa公司；熒光定量PCR所使用的試劑iTaqTMUniversal SYBR? Green Supermix及相關(guān)耗材購自BIO-RAD公司。

1.3 中華按蚊AsCYP6Z2基因克隆及生物信息學(xué)分析

AsCYP6Z2基因的預(yù)測序列來源于本實(shí)驗(yàn)室閆正文等的前期分析(Yanetal., 2016)。將該基因的預(yù)測序列作為問詢序列，比對中華按蚊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得其轉(zhuǎn)錄組序列，以此作為模板序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對引物(表1)，以溴氰菊酯抗性品系羽化0 h的成蚊和敏感品系雌蛹的腹部分別作為cDNA的模板，克隆其開放閱讀框序列?；蚩寺?shí)驗(yàn)中的PCR反應(yīng)體系(25 μL): 5×Buffer 5 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Fastpfu酶(2.5 U/μL)0.5 μL, ddH2O 15.5 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃ 20 s, 58℃ 20 s, 72℃ 35 s, 共35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5 min。引物合成及基因測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

表1 本研究所用引物

利用在線軟件ExPASy中ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)對AsCYP6Z2蛋白進(jìn)行分子量、吸光值、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的預(yù)測；AsCYP6Z2蛋白的信號肽預(yù)測使用在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)；AsCYP6Z2蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測使用TMHMM在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)；使用NCBI和Vectorbase提供的BLASTP在蛋白序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源序列，物種和基因登錄號如下：赤擬谷盜T.castaneum(XP_015834511.1)，家蠶Bombyxmori(NP_001073135.1)，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_651082.1)，埃及伊蚊Aedesaegypti(AAEL009123)，致倦庫蚊Culexquinquefasciatus(CPIJ019587)，岡比亞按蚊An.gambiae(AGAP008218)，小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(XP_011569123.1)。MEGA-X構(gòu)建進(jìn)化樹(Tamuraetal., 2013)，ClustalW比對序列，預(yù)測氨基酸序列的最佳進(jìn)化模型為LG+G，基于最大似然法(maximum likelihood, ML)計(jì)算AsCYP6Z2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，重復(fù)計(jì)算1 000次。同時(shí)，采用在線比對工具CLUSTALW(https:∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw)及GENEDOC軟件完成多序列比對分析。

1.4 AsCYP6Z2基因的時(shí)空表達(dá)譜分析

從溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR)中華按蚊雌性個(gè)體的蛹期和成蚊期的不同發(fā)育階段進(jìn)行取樣，共計(jì)12個(gè)時(shí)間點(diǎn)(蛹期0, 10, 20和30 h,蛹末期，成蚊期0, 3, 6, 9, 24，48和72 h)，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。同樣地，對溴氰菊酯敏感品系雌蛹的各區(qū)段進(jìn)行取樣，包括頭部、胸部、腹部前3節(jié)(腹部前端)和腹部剩余部分(腹部后端)。取樣使用TRizol試劑(Invitrogen, 美國)400～500 μL置于1.5 mL離心管中，保存于-80℃。液氮研磨，Trizol法提取總RNA，利用TaKaRa RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，以此cDNA為模板用于qPCR檢測。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)AsCYP6Z2的定量引物，以核糖體蛋白基因L49(RPL49)用作內(nèi)參基因(Yanetal., 2016)。qPCR反應(yīng)體系及操作參考本實(shí)驗(yàn)室喬梁等先前建立的方法(Qiaoetal., 2016)。引物序列如表1所示。

由表2可以看出,復(fù)合混沌序列有均衡的0-1比,并且滿足E<0.02的要求,滿足Golomb偽隨機(jī)假設(shè)的第一條件。

1.5 溴氰菊酯對AsCYP6Z2基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

選取化蛹3 h，健康活潑的溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)雌蛹個(gè)體，將蛹置于裝有滅菌超純水(含5 μg/mL氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿里清洗3次。清洗后用蘸有70%酒精的脫脂棉輕輕擦拭蛹體表，再將蛹放置于1×PBS的培養(yǎng)皿清洗。于滅菌載玻片上對蛹進(jìn)行迅速解剖，將蛹腹部后端置于1×PBS中洗滌5次，之后用無菌濾紙吸走液體。將3～6個(gè)腹部后端材料放入1.5 mL離心管中，離心管中加入Grace培養(yǎng)基(GIBCO BRL)且加入6 μg/mL苯硫脲以防止酚氧化酶活性；同時(shí)加入青霉素-鏈霉素;青霉素的工作濃度為100 U/mL，鏈霉素為0.1 mg/mL)。處理組材料樣本中加入25 mg/mL過濾滅菌的溴氰菊酯溶液(25 mg/mL溴氰菊酯溶液的配制：1 mL純丙酮溶液加入中1 μL的溴氰菊酯原藥)，對照組中加入等量過濾滅菌的純丙酮溶液(World Health Organization, 1981)。用錫箔紙包裹離心管后放置在水平搖床上，以25 r/min的速率和傾斜30°的角度進(jìn)行孵育，并設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。孵育溫度為24℃，在孵育時(shí)間分別為12 h和24 h時(shí)，通過qPCR檢測處理組和對照組中AsCYP6Z2基因的表達(dá)情況，檢測和分析方法同1.4節(jié)。引物序列如表1所示。

1.6 AsCYP6Z2基因的RNAi實(shí)驗(yàn)

使用P1700 T7 RiboMAXTMExpress RNAi試劑盒(美國Promega)合成dsAsCYP6Z2和對照dsEGFP雙鏈RNA。合成的雙鏈RNA溶解于無RNase的水，測定純度和濃度，并電泳檢測。合成dsRNA所需引物如表1所示。

在進(jìn)行擊倒率和死亡率表型量化前，提前選取先批次化蛹的雌蛹，注射dsAsCYP6Z2(RNAi組)和dsEGFP(對照組)，每組不少于20頭，注射劑量為800 ng，RNAi組和對照組各進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)，如表2所示。選取RNAi組和對照組蛹羽化1 h大小齊一、健康活潑且飛行良好的個(gè)體，按照每個(gè)生物學(xué)重復(fù)混合5頭雌蚊的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取樣，并設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用Trizol法提取樣本的總RNA，并使用TaKaRa RR047反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA樣本。通過qPCR檢測RNAi組和對照組中AsCYP6Z2基因的表達(dá)量，以評估RNAi對靶基因表達(dá)的抑制效果。qPCR分析中，以中華按蚊核糖體蛋白L49基因(AsRPL49)為內(nèi)參。qPCR反應(yīng)體系及操作參考本實(shí)驗(yàn)室喬梁等先前建立的方法(Qiaoetal., 2016)。所需引物見表1。

在量化擊倒率和死亡率時(shí)，依據(jù)AsCYP6Z2基因時(shí)期和部位的表達(dá)模式，我們在化蛹10 h期間向蛹的腹部后端注入dsRNA(RNAi組注射dsAsCYP6Z2，對照組注射dsEGFP)。RNAi組兩組共計(jì)注射81頭雌蚊，對照組兩組共計(jì)注射73頭雌蚊。將注射后的RNAi組和對照組的蛹吸入含5 μg/mL氨芐青霉素的超純水中，于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)羽化率。待RNAi組和對照組中成蚊羽化至1 h，選取大小齊一、活潑健康且具有良好飛行能力的個(gè)體，按照WHO接觸桶法進(jìn)行溴氰菊酯生測實(shí)驗(yàn)。詳細(xì)操作為：將RNAi組和對照組的雌蚊以25頭/筒輕輕吹入放置有0.05%溴氰菊酯藥膜的接觸桶中，吹入后立即計(jì)時(shí)，并記錄蚊蟲在接觸溴氰菊酯藥膜10, 20, 30, 40, 50和60 min時(shí)的擊倒情況，利用SPSS 25.0對RNAi組和對照組個(gè)體的進(jìn)行半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)分析。在60 min后將接觸桶中的雌蚊轉(zhuǎn)移至恢復(fù)桶內(nèi)，待其恢復(fù)24 h 后統(tǒng)計(jì)死亡率。生測實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行2次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 同源建模與分子對接

使用在線同源建模服務(wù)器Swiss-Model(http:∥swissmodel.expasy.org/)對AsCYP6Z2進(jìn)行同源建模。驗(yàn)證所建模型立體化學(xué)性質(zhì)的合理性用Proheck程序(Laskowskietal., 1993)；對所建蛋白模型中的氨基酸殘基的相容性評估使用Verify-3D程序；三維構(gòu)象的顯示與分析用PDBview。

利用ChemBioDraw Ultra 12.0繪制化合物溴氰菊酯的結(jié)構(gòu)，然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)并使用程序內(nèi)置的MMFF94立場對化合物的構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化。對接所需的蛋白以及化合物溴氰菊酯使用AutoDockTools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式后，使用AutoDock 4.2.6進(jìn)行對子對接研究(Morrisetal., 2009)。AsCYP6Z2蛋白的對接活性位點(diǎn)的坐標(biāo)設(shè)置為: center_x=55.847, center_y=77.138, center_z=12.205; size_x=8, size_y=8, size_z=8; 參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20，其余參數(shù)均使用默認(rèn)值，對接后選取得分最高的構(gòu)象，使用PyMol 2.3.4(http:∥www.pymol.org/)進(jìn)行作圖與結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 AsCYP6Z2基因的克隆和序列特征

AsCPY6Z2(GenBank登錄號: MT840336)基因的開放閱讀框(ORF)長1 251 bp，編碼416個(gè)氨基酸(圖1)。該基因氨基酸編碼序列在抗感品系間沒有差異。其氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，為10.6%。運(yùn)用SingalP5.0對AsCYP6Z2的氨基酸序列進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明AsCYP6Z2無信號肽。同時(shí)對AsCYP6Z2的氨基酸序列運(yùn)用TMHMM 2.0軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖1 中華按蚊AsCYP6Z2基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果顯示(圖3)：AsCYP6Z2基因與岡比亞按蚊AgCYP6Z2基因的親緣關(guān)系最近。氨基酸聯(lián)配分析結(jié)果表明(圖2)，AsCYP6Z2蛋白含有5個(gè)保守基序，分別為：螺旋C(WxxxR)，螺旋I(GxE/DTT/S)，螺旋K(ExLR)，PERF區(qū)(PxxFxPE/DRE)和血紅素結(jié)合區(qū)(PFxxGxRxCxG/A)。

圖2 中華按蚊AsCYP6Z2與其他昆蟲同源蛋白的序列比對

圖3 中華按蚊AsCYP6Z2與其他昆蟲CYP6基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系

2.2 AsCYP6Z2基因的時(shí)空表達(dá)模式

不同發(fā)育階段的表達(dá)分析結(jié)果顯示：在化蛹0 h，AsCYP6Z2基因的表達(dá)量非常低，且在抗感品系(YN-LR和WX-LS)間沒有明顯的表達(dá)差異。在敏感品系中，盡管AsCYP6Z2基因的表達(dá)量隨著發(fā)育變化上調(diào)，但上調(diào)變化并不劇烈。而在抗性品系中，該基因在化蛹末期至成蚊羽化3 h間的表達(dá)量明顯上調(diào)，其程度以蛹末期和剛羽化時(shí)最為顯著。此外，在蛹末期、羽化0, 3和72 h，抗性品系中該基因的表達(dá)量顯著高于敏感品系(P<0.05)。雌蛹不同部位的表達(dá)分析結(jié)果顯示：AsCYP6Z2基因在蛹腹部后端的表達(dá)量最高，其次是腹部前端和胸部，而頭部中的表達(dá)量最低。依據(jù)發(fā)育階段和組織表達(dá)模式結(jié)果，將化蛹10 h作為RNAi注射的時(shí)間點(diǎn)，注射部位為雌蛹腹部后端。

圖4 AsCYP6Z2基因在中華按蚊溴氰菊酯抗感品系不同發(fā)育階段(A)和溴氰菊酯敏感品系雌蛹不同組織(B)中的表達(dá)模式

2.3 溴氰菊酯對AsCYP6Z2基因的誘導(dǎo)表達(dá)

中華按蚊雌蛹腹部后端在25 mg/mL溴氰菊酯溶液中培養(yǎng)后的結(jié)果顯示：12 h后，處理組中AsCYP6Z2的表達(dá)量較對照組(純丙酮溶液培養(yǎng))上調(diào)了4倍(P<0.01)；而在24 h后，處理組中AsCYP6Z2的表達(dá)量較對照組則上調(diào)了13倍(P<0.001)。這些結(jié)果表明溴氰菊酯能夠誘導(dǎo)AsCYP6Z2基因的顯著上調(diào)表達(dá)。

圖5 中華按蚊雌蛹腹部后端經(jīng)溴氰菊酯處理12 h(A)和24 h(B)后AsCYP6Z2基因的表達(dá)量變化

2.4 RNAi干擾AsCYP6Z2后中華按蚊對溴氰菊酯敏感性的變化

在RNAi實(shí)驗(yàn)中，蚊蟲羽化率均在90%以上(表2)。通過RNAi沉默AsCYP6Z2基因后，結(jié)合qPCR檢測該基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，與對照組相比，RNAi組中AsCYP6Z2表達(dá)量下調(diào)了約80%(P<0.0001)(圖6: A)，說明通過RNAi有效地抑制了AsCYP6Z2基因的表達(dá)。

表2 RNAi實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

RNAi后雌成蚊接觸0.05%溴氰菊酯藥膜1 h內(nèi)的擊倒曲線顯示：RNAi組從生測10 min開始即出現(xiàn)擊倒現(xiàn)象；而對照組則是從30 min時(shí)才開始出現(xiàn)擊倒現(xiàn)象。兩者間呈現(xiàn)出明顯的擊倒差異(Log-rankP<0.01)(圖6: B)。根據(jù)蚊蟲在生測期間的擊倒個(gè)數(shù)(表3)，所計(jì)算的半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)顯示：RNAi組中溴氰菊酯對雌成蚊的KT50=31.789±3.459 min，對照組中溴氰菊酯對雌成蚊的KT50=41.107±3.716 min。此外，接觸0.05%溴氰菊酯藥膜1 h并經(jīng)24 h恢復(fù)后，RNAi組中蚊蟲的死亡率比照組增加了17%(P<0.05)(圖6: C)。RNAi結(jié)果說明，沉默AsCYP6Z2基因后中華按蚊對溴氰菊酯的敏感性顯著增加，表明AsCYP6Z2基因在蚊蟲對溴氰菊酯的抗性上有重要作用。

圖6 RNAi干擾AsCYP6Z2后中華按蚊雌成蚊對溴氰菊酯敏感性的變化

表3 RNAi干擾AsCYP6Z2后生測期間中華按蚊雌成蚊擊倒個(gè)數(shù)

2.5 AsCYP6Z2與溴氰菊酯的分子對接分析

以AsCYP6Z2的氨基酸序列為模板，RCSB Protein Data Bank網(wǎng)站中在線搜索，比對出智人HomosapiensCYP3A5(PDB:6MJM)蛋白序列與AsCYP6Z2的同源性最高，序列一致性為39%。選取CYP3A5的三維結(jié)構(gòu)作為同源建模的模板，對AsCYP6Z2進(jìn)行同源建模，得到AsCYP6Z2的二聚體三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖7: A)。將溴氰菊酯對接至AsCYP6Z2，溴氰菊酯以互補(bǔ)的方式結(jié)合在AsCYP6Z2的結(jié)合口袋，分子對接預(yù)測結(jié)果顯示：溴氰菊酯的母核苯環(huán)以及側(cè)鏈的酯羰基分別與Cys-155形成Pi-硫相互作用以及穩(wěn)定的氫鍵，側(cè)鏈的二溴乙烯基片段與二甲基環(huán)丙基片段則可以與口袋兩側(cè)的Ala-165, Val-72, Leu-76, Leu-82和Ala-24形成穩(wěn)定的疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖7: B)。根據(jù)對接結(jié)果推測，溴氰菊酯與AsCYP6Z2在疏水作用和氫鍵等的相互作用下可能形成穩(wěn)定復(fù)合物。

圖7 AsCYP6Z2蛋白與溴氰菊酯的分子對接模型

3 討論

有研究報(bào)道表明，轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)表達(dá)可能是細(xì)胞色素P450酶系活性增強(qiáng)的重要因素之一(Liu and Scott, 1998; Lietal., 2006)。例如，在家蠅Muscadomestica的抗性品系中，CYP6D1,CYP6A24和CYP6D3v2基因存在過量表達(dá)現(xiàn)象，家蠅擬除蟲菊酯的抗性可能與上述P450基因的過表達(dá)有關(guān)(Kamiyaetal., 2001)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中，CYP6M2和CYP6P3能夠代謝氯菊酯和溴氰菊酯，并且在野外抗性種群中上調(diào)表達(dá)(Djouakaetal., 2008)；CYP6P9,CYP6P4,CYP6Z1,CYP6Z3和CYP6M7被報(bào)道在催命按蚊Anophelesfunestus中與擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗性密切相關(guān)(Davidetal., 2013; Riveronetal., 2013)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae與阿拉伯按蚊Anophelesarabiensis中，CYP6Z1,CYP6Z2和CYP6M2等顯著上調(diào)表達(dá)后，可能增強(qiáng)上述基因編碼產(chǎn)物在氯菊酯代謝過程中的作用(Chiuetal., 2011; Munhenga and Koekemoer, 2011)。研究表明，上調(diào)基因中的CYP6, CYP9和CYP4亞家族成員，與蚊蟲對殺蟲劑的抗性有關(guān)，其中CYP6家族被認(rèn)為與抗藥性關(guān)系最為密切的家族(Feyereisenetal., 2006; Yanetal., 2016)。AsCYP6Z2基因?qū)儆贑YP6家族，其表達(dá)量在抗性品系中明顯上調(diào)。我們推測，AsCYP6Z2基因的上調(diào)表達(dá)可能是YN-LR品系中維持溴氰菊酯抗性的因素之一。在昆蟲中，中腸、脂肪體和馬氏管等器官中P450的活性通常較高，并且被認(rèn)為是主要的解毒代謝器官(Brunetal., 1996)。飛蝗細(xì)胞色素P450基因LmCYP6FD3在馬氏管、中腸中高表達(dá)，顯示出該基因在外源物質(zhì)解毒過程中發(fā)揮重要作用(朱文雅等, 2017)。AsCYP6Z2基因在腹部的表達(dá)量明顯高于在其他部位，而腹部是重要的代謝組織如中腸、馬氏管所在的場所。因此，腹部可能是AsCYP6Z2蛋白行使生物學(xué)功能的主要部位。在后續(xù)的研究中，在全面調(diào)查AsCYP6Z2基因全發(fā)育和全組織表達(dá)模式的基礎(chǔ)上，將研究該基因在不同品系與不同組織間表達(dá)調(diào)控差異的分子基礎(chǔ)。

已有大量證據(jù)表明，多種昆蟲中的P450基因家族成員在殺蟲劑抗性方面有重要功能。例如，沉默小菜蛾CYP321E1基因后，幼蟲對氯蟲酰胺殺蟲劑的抵抗能力明顯減弱，而引起其死亡率明顯增加(Huetal., 2014)；沉默抗性品系小菜蛾P(guān).xylostella幼蟲體內(nèi)過量表達(dá)的CYP6BG1基因后，導(dǎo)致幼蟲對芐氯菊酯殺蟲劑的抗性顯著降低(Bautistaetal., 2008)；淡色庫蚊CulexpipienspallensCYP6AA9基因隨著溴氰菊酯抗性水平的提高，其表達(dá)水平也不斷提高，利用RNAi技術(shù)沉默抗性品系(Lab-DR2)CYP6AA9基因，導(dǎo)致淡色庫蚊的死亡率顯著增加(Lvetal., 2016)。本研究中，AsCYP6Z2基因被沉默后，蚊蟲對溴氰菊酯的敏感度顯著增加，死亡率明顯升高，這初步證實(shí)了AsCYP6Z2基因在溴氰菊酯抗性表型維持中的功能。這也為今后建立該基因的突變敲除系，并更全面系統(tǒng)評估其功能表型提供了參考。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯可被細(xì)胞色素P450羥基化。例如，在油菜花露尾甲Meligethesaeneus中，CYP6BQ23在抗擬除蟲菊酯類殺蟲劑的幼蟲和成蟲中過量表達(dá)，且重組表達(dá)的CYP6BQ23表現(xiàn)出對溴氰菊酯的羥基化催化活性(Zimmeretal., 2014)。在埃及伊蚊Aedesaegypti中，重組表達(dá)的CYP6Z8能夠代謝擬除蟲菊酯，產(chǎn)生3-苯氧基苯甲醇和3-苯氧基苯甲醛(Chandor-Proustetal., 2013)。在我們的研究中，分子對接預(yù)測結(jié)果暗示AsCYP6Z2與溴氰菊酯間可能存在互作，推測其可能參與催化溴氰菊酯代謝。在此基礎(chǔ)上，今后將會探究AsCYP6Z2的酶學(xué)性質(zhì)與殺蟲劑代謝機(jī)理。