陳高滿, 陳展博, 葛 輝, 楊雪清,*, 王小奇，*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866; 2.遼寧省經(jīng)濟(jì)與應(yīng)用昆蟲教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110866)

蘋果蠹蛾Cydiapomonella屬鱗翅目卷蛾科，是全球仁果類水果種植地區(qū)最重要的果樹害蟲之一，也是我國(guó)一類進(jìn)境檢疫性有害生物，對(duì)全球水果種植業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(周文等, 2010)。張學(xué)祖(1957)首次報(bào)道了該蟲在我國(guó)新疆地區(qū)的發(fā)生。截止目前，蘋果蠹蛾已在新疆地區(qū)、甘肅大部以及寧夏、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧的局部地區(qū)發(fā)生(張潤(rùn)志等, 2012; 房陽(yáng)等, 2018)，對(duì)我國(guó)黃土高原和環(huán)渤海灣兩大蘋果優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成極大威脅(楊雪清, 2014; 房陽(yáng)等, 2018)。蘋果蠹蛾寄主廣泛，包括蘋果、梨、沙果、海棠等30余種水果(楊雪清, 2014)。近年來的研究表明，這些寄主果實(shí)中富含酚類、生物堿類、類黃酮類等植物次生物質(zhì)(Bernays,1990; Eylesetal., 2010)。植物次生物質(zhì)會(huì)對(duì)昆蟲生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，破壞昆蟲體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)，它們?cè)诶ハx體內(nèi)積累會(huì)對(duì)昆蟲產(chǎn)生毒害作用(Bennett and Wallsgrove, 1994)。因此,了解蘋果蠹蛾對(duì)寄主果實(shí)中植物次生物質(zhì)的反應(yīng)有助于加深植食性昆蟲-植物協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的認(rèn)識(shí)，揭示蘋果蠹蛾入侵的適應(yīng)性機(jī)制。

植食性昆蟲與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化是生命科學(xué)中的經(jīng)典科學(xué)問題(Jensenetal., 2011)。在長(zhǎng)達(dá)4億年進(jìn)化過程中，植物產(chǎn)生一系列有效的防御系統(tǒng)，如合成能引起植食性昆蟲忌避、拒食、中毒或影響昆蟲消化和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收的有毒植物次生物質(zhì)，以保護(hù)它們免受植食性昆蟲的危害，植食性昆蟲則演化出了復(fù)雜的解毒代謝機(jī)制以應(yīng)對(duì)寄主中的植物次生物質(zhì)(Schuler, 2011, 2012；Stahletal., 2018)。細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450或CYP)是Ⅰ階段解毒酶，主要參與昆蟲對(duì)內(nèi)源(如激素等)和外源性化合物(如植物次生物質(zhì)、殺蟲劑等)的解毒代謝(Liuetal., 2006; Lietal., 2007; Schuler, 2011)。P450是由多個(gè)基因家族組成的基因超家族，幾乎在所有生物中都有分布(Feyereisen, 2011)。目前，昆蟲P450基因超家族可分為4個(gè)進(jìn)化枝，即CYP2, CYP3, CYP4和線粒體CYP進(jìn)化枝(Callaetal., 2017)。其中，主要由CYP6, CYP9, CYP321, CYP332和CYP337家族組成的CYP3進(jìn)化枝是最受關(guān)注的，這個(gè)進(jìn)化枝的P450基因普遍參與昆蟲對(duì)蛻皮激素和保幼激素等內(nèi)源物質(zhì)，以及植物次生物質(zhì)和殺蟲劑等外源物質(zhì)的代謝作用(Feyereisen, 2006)。例如，美洲棉鈴蟲Helicoverpazea的CYP6B8和CYP321A1可以代謝黃嘌呤毒素和當(dāng)歸素等植物次生物質(zhì)(Rupasingheetal., 2007)。亞洲棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraCYP6B6基因的表達(dá)水平與2-十三烷酮的濃度相關(guān)，取食含2-十三烷酮和槲皮素的人工飼料后，幼蟲中腸和脂肪體內(nèi)CYP6B6基因的表達(dá)水平明顯升高(Liuetal., 2006)。類似的結(jié)果在家蠶Bombyxmori中也有報(bào)道。飼喂含槲皮素的人工飼料后，家蠶幼蟲中腸P450活性被誘導(dǎo)升高了2.3倍(Zhangetal., 2012)。這些結(jié)果表明了P450的解毒代謝作用是昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)適應(yīng)性的分子機(jī)制之一(Wenetal., 2003; Lietal., 2004)。另外，在蘋果蠹蛾中已鑒定出幾個(gè)參與昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒代謝的P450基因，如CYP6B2(Wanetal., 2019)和CYP9A61(Yangetal., 2017)。這些研究結(jié)果表明，蘋果蠹蛾CYP3進(jìn)化枝中的P450基因可能與其他昆蟲CYP3基因一樣參與異源物質(zhì)的解毒代謝。

從生物合成途徑上，植物次生代謝物質(zhì)可分成酚類、類菇、含氮化合物和其他次生物質(zhì)四大類，其中酚類物質(zhì)是一種重要的植物自我防御物質(zhì)(徐正浩等, 2004; 鄧?guó)欙w等, 2011)。香豆素和槲皮素是兩種苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑的酚類產(chǎn)物。呋喃香豆素能夠在昆蟲和其他生物體內(nèi)被活化并與DNA鏈交聯(lián)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，因此具有高毒性(邱星輝和冷欣夫, 2002)。槲皮素是植物界中種類最豐富的類黃酮之一，能夠在昆蟲中腸形成超氧自由基和其他活性氧影響昆蟲的消化系統(tǒng)(Simmonds, 2003)。已有研究報(bào)道兩種次生代謝物質(zhì)對(duì)昆蟲解毒代謝酶的影響。例如，斜紋夜蛾Spodopteralitura在取食香豆素48 h后，脂肪體中P450酶含量相較對(duì)照組提高14.50倍(王瑞龍等, 2012)；0.1 mg/g濃度的槲皮素誘導(dǎo)亞洲棉鈴蟲體內(nèi)CYP337B1的表達(dá)量升高了2倍(Liuetal., 2015)。另外蘋果蠹蛾的寄主植物如蘋果、梨的果實(shí)中富含槲皮素和香豆素等多種酚類物質(zhì)(Tanr?ven and Eki, 2005; Marksetal., 2007)。綜上，在本研究中我們選取香豆素和槲皮素，根據(jù)果實(shí)中具體濃度稍作調(diào)整混合到人工飼料中檢測(cè)蘋果蠹蛾對(duì)次生代謝物質(zhì)的分子響應(yīng)。

在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)CYP3家族中有兩個(gè)P450基因的表達(dá)水平對(duì)植物次生物質(zhì)有明顯響應(yīng)，經(jīng)克隆并鑒定后分別命名為CYP332A19和CYP337B19。在本研究中，我們分析了其分子特性，明確了這兩個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)特性，以及分別取食含0.1%香豆素(coumarin)和0.5%槲皮素(quercetin)的人工飼料后的基因表達(dá)水平，推測(cè)這兩個(gè)基因可能參與植物次生代謝物質(zhì)的解毒作用，可為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本實(shí)驗(yàn)所用的蘋果蠹蛾蟲源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)入侵生物預(yù)防與監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室提供，該品系已在室內(nèi)不接觸任何藥劑和植物毒素連代飼養(yǎng)超50代。供試蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段試蟲為人工飼養(yǎng)箱(MLR-352H-PC, Panasonic)用蘋果蠹蛾人工飼料(劉國(guó)鋒等, 2016)飼養(yǎng)所得，飼養(yǎng)條件為：溫度26±1℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 供試藥劑

香豆素(純度≥98%)和槲皮素(純度≥98%)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol Reagent, pMD19-T, Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser, Premix Taq(Version 2.0), TB Green Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自TaKaRa公司；二甲基砜(DMSO)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 基因克隆、測(cè)序和鑒定

以煙草天蛾ManducasextaCYP332A5(GenBank登錄號(hào): ADE05588.1)、東方虎鳳蝶PapilioglaucusCYP332A35(GenBank登錄號(hào): DAB41816.1)、亞洲棉鈴蟲H.armigeraCYP337B2(GenBank登錄號(hào): AFO72905.1)和甜菜夜蛾SpodopteraexiguaCYP337B5(GenBank登錄號(hào): ASO98023.1)等近緣昆蟲細(xì)胞色素P450蛋白序列為詢問序列，在蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào): SRX371333)中使用軟件blast-2.2.31+軟件包中的tblastn程序進(jìn)行本地BLAST，期待值E設(shè)為≤10-5，鑒定出兩條蘋果蠹蛾細(xì)胞色素P450基因cDNA序列。參照本實(shí)驗(yàn)室前期的方法(楊雪清, 2014)，合成蘋果蠹蛾cDNA第1鏈并作為PCR擴(kuò)增的模板。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的引物(表1)。PCR反應(yīng)體系(20 μL): Premix Taq 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性1 min, 60℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠后，于紫外光下用消毒干凈刀片切下含目的片段的膠塊，使用膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit, Omega)回收純化。目的片段連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆并在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h，菌液經(jīng)PCR驗(yàn)證后送至上海生工生物有限公司測(cè)序。DNA測(cè)序驗(yàn)證后的序列經(jīng)P450命名委員會(huì)根據(jù)細(xì)胞色素P450命名與分類方法對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行命名(Nelson, 2006)，后上傳至GenBank(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.4 基因序列分析

利用ExPASy在線網(wǎng)站(http:∥ca.expasy.org/tools/)中的Compute pI/Mw預(yù)測(cè)P450蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)。利用PSIPRED 3.3(http:∥www.biologydir.com/protein-structure-prediction-server-psipred-info-1758.html)預(yù)測(cè)P450的二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用DNAMAN對(duì)推導(dǎo)的P450氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。通過SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org)構(gòu)建P450的3D結(jié)構(gòu)(Arnold, 2006)。使用MEGA 6.0軟件(Tamuraetal., 2013)中的鄰接法(NJ)構(gòu)建CYP332A19和CYP337B19與近緣昆蟲的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)為1 000，分析蘋果蠹蛾P(guān)450與近緣物種P450的進(jìn)化關(guān)系。

1.5 CYP332A19和CYP337B19基因表達(dá)水平分析

選取蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段試蟲，各發(fā)育階段每個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別包括100粒受精卵，50頭1齡幼蟲，50頭2齡幼蟲，30頭3齡幼蟲，10頭4齡幼蟲，10頭5齡幼蟲，雄、雌蛹各5頭，雄、雌成蟲各5頭。卵在產(chǎn)卵當(dāng)天取樣，1齡幼蟲在孵化后1 d取樣，2-5齡幼蟲在蛻皮后1 d取樣，蛹在化蛹當(dāng)天取樣，成蟲在羽化后1 d取樣。將同一發(fā)育時(shí)期的個(gè)體混在一起提取總RNA。挑選大小相似的30頭4齡幼蟲作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，解剖其頭、表皮、脂肪體、中腸和馬氏管等不同組織樣品，提取總RNA。各發(fā)育階段和組織均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

次生物質(zhì)濃度參照水果中香豆素和槲皮素的實(shí)際含量并略做調(diào)整。將0.1 g香豆素和0.5 g槲皮素分別溶于2 mL DMSO后，添加至100 g人工飼料中混合分別制成含0.1%香豆素和0.5%槲皮素的毒素飼料。由于蘋果蠹蛾4齡幼蟲處于體重快速增長(zhǎng)期，因此挑選生長(zhǎng)狀況一致的2日齡4齡幼蟲作為植物毒素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)材料。處理組將含毒素飼料切成體積1 cm×1 cm×1 cm的小塊，置于24孔板中單孔單頭飼養(yǎng)，對(duì)照組人工飼料混合同樣混合2% DMSO，其他條件相同。飼喂后，將24孔板置于人工飼養(yǎng)箱中，2 d后取樣。每個(gè)處理30頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

樣品經(jīng)液氮速凍后放置于-80℃冰箱保存?？俁NA的提取和cDNA模板的制備方法同1.3節(jié)。以蘋果蠹蛾β-actin(楊雪清和張雅林, 2014)作為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR方法分析蘋果蠹蛾P(guān)450基因在不同發(fā)育階段和不同組織，以及取食含植物次生物質(zhì)人工飼料后的表達(dá)水平。P450基因RT-qPCR引物(表1)由上海生工生物有限公司合成。采用Bio-Rad CFX96 PCR儀(Bio-Rad, 美國(guó))進(jìn)行一步法擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL): TB Green Premix Ex Taq 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, cDNA模板 1 μL, ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)以不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA作陰性對(duì)照，以及以ddH2O代替cDNA模板作空白對(duì)照。

表1 本研究中所用到的引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

蘋果蠹蛾細(xì)胞色素P450基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，并采用SPSS 19(IBM)軟件中的Duncan氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19基因的克隆及序列分析

通過搜索、比對(duì)、克隆和DNA測(cè)序，獲得了蘋果蠹蛾2個(gè)細(xì)胞色素P450基因的全長(zhǎng)cDNA序列，兩個(gè)基因分別命名為CYP332A19(GenBank登錄號(hào): MF574708)和CYP337B19(GenBank登錄號(hào): MF574697)。CYP332A19的ORF長(zhǎng)1 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸，其預(yù)測(cè)的蛋白分子量為58.586 kD，理論等電點(diǎn)為8.99。CYP337B19的ORF長(zhǎng)1 491 bp，編碼496個(gè)氨基酸，其預(yù)測(cè)的蛋白分子量為57.734 kD，理論等電點(diǎn)為7.61。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，蘋果蠹蛾CYP332A19與蘋淡褐卷蛾EpighyaspostvittanaCYP332A9(GenBank登錄號(hào): DAB41784.1)、歐洲防風(fēng)草結(jié)網(wǎng)毛蟲DepressariapastinacellaCYP332A13(GenBank登錄號(hào): DAB41820.1)、黑紋粉蝶PierismeleteCYP332A16(GenBank登錄號(hào): AXB26402.1)和煙草天蛾M.sextaCYP332A5(GenBank登錄號(hào): ADE05588.1)的氨基酸序列一致性分別高達(dá)83.03%, 64.80%, 64.29%和59.00%。蘋果蠹蛾CYP337B19與六星燈蛾ZygaenafilipendulaeCYP337B11(GenBank登錄號(hào): ASX93990.1)、亞洲棉鈴蟲H.armigeraCYP337B2(GenBank登錄號(hào): AFO72905.1)和CYP337B1(GenBank登錄號(hào): AFO72901.1)以及稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisCYP337B12(GenBank登錄號(hào): AJN91181.1)的氨基酸序列一致性分別高達(dá)55.78%, 57.94%, 56.17%和56.62%。

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19均包含典型的細(xì)胞色素P450識(shí)別特征，如血紅素結(jié)合區(qū)序列PFxxGxRxCxG、C螺旋序列WxxxR、I螺旋序列DTT/S、CYP6家族特征序列ExxR、“Meander”區(qū)序列PxxFxPxxF(圖1)。選取與蘋果蠹蛾CYP332A19和CP337B19同源性分別為29.55%的人HomosapiensCYP3A4(PDBe: 5a1p)和27.35%的人CYP3A5(PDBe: 5veu)的晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過SWISS-MODEL在線軟件構(gòu)建了CYP332A19和CYP337B19的3D模型。結(jié)果表明，CYP332A19由23個(gè)α-螺旋和10個(gè)β-折疊組成, CYP337B19由22個(gè)α-螺旋和10個(gè)β-折疊組成(圖2)。

圖1 蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19推導(dǎo)的氨基酸序列對(duì)比

圖2 蘋果蠹蛾CYP332A19(A)和CYP337B19(B)3D結(jié)構(gòu)的同源建模

2.2 蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19基因的系統(tǒng)發(fā)育

進(jìn)化樹顯示，蘋果蠹蛾CYP332A19與蘋淡褐卷蛾CYP332A9等CYP332A亞家族基因聚在一支，而CYP337B19與稻縱卷葉螟C.medinalisCYP337B12和六星燈蛾Z.filipendulaeCYP337B11等CYP337B亞家族基因聚在另一支，表明所克隆的蘋果蠹蛾P(guān)450基因分別為CYP332A和CYP337B兩個(gè)亞家族基因(圖3)。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19和近緣昆蟲細(xì)胞色素P450的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))

2.3 CYP332A19和CYP337B19在蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

不同發(fā)育階段表達(dá)模式結(jié)果表明，CYP332A19和CYP337B19基因在蘋果蠹蛾所有發(fā)育階段均有表達(dá)，在卵期和蛹期的表達(dá)水平相對(duì)較低。CYP332A19在幼蟲期隨蟲齡增長(zhǎng)表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，在蛹和成蟲期呈現(xiàn)出明顯的性別差異表達(dá)模式(圖4: A)。CYP337B19在幼蟲期的表達(dá)水平較CYP332A19高，成蟲期不同性別間無顯著表達(dá)差異(P>0.05)(圖4: B)。

圖4 蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段CYP332A19(A)和CYP337B19(B)的表達(dá)譜

2.4 CYP332A19和CYP337B19在蘋果蠹蛾中的組織特異性表達(dá)模式

組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，CYP332A19在蘋果蠹蛾4齡幼蟲脂肪體中的表達(dá)量最高，在表皮中的表達(dá)量次之，在馬氏管、頭部和中腸中的表達(dá)量較低(圖5: A)。CYP337B19在4齡幼蟲中腸中表達(dá)量最高，在脂肪體中次之，在馬氏管中未檢測(cè)到其表達(dá)(圖5: B)。

圖5 蘋果蠹蛾4齡幼蟲不同組織中CYP332A19(A)和CYP337B19(B)的表達(dá)模式

2.5 植物次生物質(zhì)處理后蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19基因的表達(dá)水平

取食分別含0.1%香豆素(Cou)和0.5%槲皮素(Que)的人工飼料2 d后蘋果蠹蛾4齡幼蟲CYP332A19(圖6: A)和CYP337B19(圖6: B)的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(取食含2% DMSO的人工飼料)(P<0.05)。CYP332A19基因被0.1%香豆素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)倍數(shù)達(dá)7.06倍，高于被0.5%槲皮素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的倍數(shù)(2.01倍)；CYP337B19基因被0.5%槲皮素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)倍數(shù)達(dá)6.40倍，高于被0.1%香豆素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的倍數(shù)(1.99倍)。

圖6 植物次生物質(zhì)誘導(dǎo)2 d后蘋果蠹蛾4齡幼蟲中CYP332A19(A)和CYP337B19(B)的表達(dá)量

3 討論

為應(yīng)對(duì)寄主植物中的植物次生物質(zhì)，植食性昆蟲演化出復(fù)雜的解毒代謝機(jī)制，有效地代謝植物次生物質(zhì)使昆蟲免受毒害，其中P450是最為重要的解毒酶(Harrisonetal., 2001; Brownetal., 2005)。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在以北美黑鳳蝶Papiliopolyxenes、美洲棉鈴蟲H.zea和亞洲棉鈴蟲H.armigera為研究模型開展的系列研究中取得了許多重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，如黃酮、黃嘌呤毒素、香豆素、吲哚和棉酚等植物次生物質(zhì)可以誘導(dǎo)植食性昆蟲的P450基因的表達(dá)(Liuetal., 2006; Rupasingheetal., 2007; Usha Rani and Pratyusha, 2013; Chenetal., 2019; Sunetal., 2019)。進(jìn)一步研究表明，北美黑鳳蝶P.polyxenesCYP6B1和CYP6B3能代謝寄主植物中的呋喃香豆素(Hungetal., 1995; Wenetal., 2003)。亞洲棉鈴蟲H.armigeraCYP6AE基因簇中(共9個(gè)P450基因)有5個(gè)P450基因參與昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)花椒毒素和2-十三烷酮，以及殺蟲劑(順式氰戊菊酯和茚蟲威)的解毒代謝，這賦予了棉鈴蟲對(duì)多種寄主植物次生代謝物質(zhì)的解毒能力(Wangetal., 2018)。這些研究表明，植食性昆蟲P450的解毒代謝作用是宿主對(duì)植物次生物質(zhì)適應(yīng)性分子機(jī)制。

在本研究中，我們繼CYP9A61(Yangetal., 2017)和CYP6B2(Wanetal., 2019)之后，克隆到兩個(gè)新的蘋果蠹蛾P(guān)450基因，分別命名為CYP332A19和CYP337B19，其ORF區(qū)序列長(zhǎng)分別為1 518 bp和1 491 bp，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列分別含505和496個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，CYP332A19與蘋淡褐卷蛾E.postvittana的CYP332A9基因編碼的氨基酸序列相似性較高，CYP337B19與六星燈蛾Z.filipendulae的CYP337B11基因編碼的氨基酸序列相似性較高(圖1)；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，兩個(gè)基因分別隸屬于CYP3進(jìn)化枝下的CYP332A和CYP337B亞家族(圖3)。研究表明，K螺旋、C螺旋、I螺旋以及血紅素結(jié)合區(qū)被認(rèn)為是P450家族的共同特征(邱星輝和冷欣夫, 2002)。其中，高度保守的血紅素結(jié)合區(qū)的FxxGxxxCxG結(jié)構(gòu)，是判斷細(xì)胞色素P450的主要標(biāo)志(朱昌亮等, 1999)。本研究克隆得到的CYP332A19和CYP337B19基因，其編碼蛋白中預(yù)測(cè)到含P450蛋白質(zhì)家族結(jié)構(gòu)域以及高度保守的FxxGxxxCxG結(jié)構(gòu)序列。此外，同源建模結(jié)果(圖2)也顯示出CYP332A19和CYP337B19的3D結(jié)構(gòu)中含有這些P450家族的共同特征，表明這兩個(gè)基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450基因家族。

解毒酶基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式，在一定程度上可以暗示基因的功能(楊雪清, 2014)。為深入了解CYP332A19和CYP337B19基因的功能，我們采用RT-qPCR方法分析了這兩個(gè)P450基因在蘋果蠹蛾中的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果表明，CYP332A19和CYP337B19基因在蘋果蠹蛾的卵期、幼蟲期、蛹期和成蟲期均有表達(dá)，其表達(dá)量均在卵期最低，在幼蟲期高表達(dá)(圖4)。這與蘋果蠹蛾CYP9A61基因(Yangetal., 2017)和致倦庫(kù)蚊CulexquinquefasciatusCYP4H34和CYP9M10基因(Komagataetal., 2010)的表達(dá)模式相似，與飛蝗LocustamigratoriaCYP6FD3隨齡期增長(zhǎng)先升高后降低，到成蟲期降至最低的表達(dá)模式(朱文雅等, 2017)相異。組織特異性表達(dá)模式結(jié)果表明，蘋果蠹蛾CYP332A19在4齡幼蟲脂肪體中的表達(dá)量最高，而CYP337B19在中腸中表達(dá)量最高(圖5)。由于中腸是昆蟲的消化器官，脂肪體的主要功能是儲(chǔ)存能量以及對(duì)外界有毒物質(zhì)的代謝(楊雪清, 2014)；在這兩個(gè)組織中高表達(dá)，暗示蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19基因可能參與異源物質(zhì)的解毒代謝。

已有一些研究表明，昆蟲CYP332A和CYP337B亞家族的P450基因參與植食性昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)和殺蟲劑的解毒代謝作用。例如，六星燈蛾Z.filipendulae中隸屬同一亞家族的CYP332A3參與昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)氰甙的代謝作用(Jensenetal., 2011)；亞洲棉鈴蟲H.armigeraCYP337B3能夠代謝擬除蟲菊酯殺蟲劑氰戊菊酯(Jou?enetal., 2012)。在煙草天蛾中腸中高表達(dá)的CYP332A4和CYP332A5基因參與異源物質(zhì)的解毒代謝(Pauchetetal., 2010)。在本研究中，蘋果蠹蛾CYP332A19和CYP337B19基因的轉(zhuǎn)錄水平被果實(shí)中普遍存在的植物次生物質(zhì)香豆素和槲皮素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。有意思的是，兩個(gè)基因受不同次生物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)幅度不同：香豆素誘導(dǎo)后CYP332A19基因表達(dá)水平上調(diào)高達(dá)7.06倍，而CYP337B19僅上調(diào)了1.99倍；與此相反，CYP337B19被槲皮素誘導(dǎo)后表達(dá)水平上調(diào)了6.40倍，而CYP332A19僅上調(diào)了2.01倍(圖6)。這種同一植物次生物質(zhì)對(duì)不同P450基因的誘導(dǎo)情況有所不同的現(xiàn)象，提示P450基因在應(yīng)對(duì)不同植物次生物質(zhì)中有不同的分工，這可能是蘋果蠹蛾幼蟲為適應(yīng)不同寄主植物中的次生物質(zhì)而產(chǎn)生的一種適應(yīng)性機(jī)制。然而，并非所有的植物次生物質(zhì)都可以誘導(dǎo)植食性昆蟲P450基因的表達(dá)上調(diào)。例如，北美黑鳳蝶P.polyxenesCYP6B1對(duì)花椒毒素的解毒作用受呋喃色酮、類黃酮和生物堿等植物次生物質(zhì)抑制(Wenetal., 2006)。棉酚使亞洲棉鈴蟲H.armigeraCYP9A12和CYP9A17基因在中腸的表達(dá)水平分別下調(diào)了2.1倍和1.9倍(Zhouetal., 2010)。

綜上所述，本研究克隆了蘋果蠹蛾兩個(gè)CYP3進(jìn)化枝中隸屬于CYP332A和CYP337B亞家族的P450基因CYP332A19和CYP337B19的cDNA序列。這兩個(gè)P450基因氨基酸序列中包含昆蟲P450基因典型識(shí)別特征，并與近緣昆蟲的CYP332A和CYP337B亞家族基因在進(jìn)化樹上聚在同一枝，暗示它們?cè)醋酝蛔嫦?。進(jìn)一步的基因表達(dá)分析研究結(jié)果表明，CYP332A19和CYP337B19可能參與蘋果蠹蛾對(duì)植物次生物質(zhì)的解毒代謝。由于蘋果蠹蛾體內(nèi)核酸降解酶(RNase)對(duì)dsRNA的降解導(dǎo)致RNA干擾(RNAi)效果不佳(黃岳, 2018)，本實(shí)驗(yàn)室目前僅成功干擾了一個(gè)CYP9A亞家族的P450基因，CYP332A19和CYP337B19的RNAi有待推進(jìn)。此外，這兩個(gè)P450基因在異源物質(zhì)體外代謝中的功能也有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果有助于加深我們對(duì)蘋果蠹蛾對(duì)寄主植物中化學(xué)防御物質(zhì)脅迫的進(jìn)化策略的了解，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)基因的功能提供參考。