梁 悅 劉 濤 李松洋 葉 萌 王 晨 吳 磊

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院， 四川 成都 610041； 2.成都大學(xué)， 四川 成都 610106）

生脈注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊(cè)（WS3-B-2865-98-2011），但其中規(guī)定的指紋圖譜方法所得色譜峰1、2、3、7、8、9、10、15、16 均未達(dá)到基線分離，尚有待進(jìn)一步提升；對(duì)色譜柱要求高（親水柱），導(dǎo)致在實(shí)際操作過(guò)程中增加了分析成本，不利于推廣使用；僅對(duì)紅參有效成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1及五味子中五味子醇甲含有量進(jìn)行了測(cè)定，尚未涉及其余類(lèi)型人參皂苷、木脂素及麥冬有效成分。

一測(cè)多評(píng)法是指選取1 個(gè)內(nèi)標(biāo)，通過(guò)建立它與其他成分的相對(duì)校正因子來(lái)測(cè)定含有量，可很好地解決中藥成分分離難度大、單體不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等問(wèn)題，具有檢測(cè)成本低、分析速度快等諸多優(yōu)勢(shì)［1-5］。目前，該方法已在中藥行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用［6-9］，并收錄于2015 年版《中國(guó)藥典》，從2010年版的1 個(gè)品種增至9 個(gè)。

特征圖譜常通過(guò)HPLC、GC、LC-MS、GC-MS等手段建立，其中HPLC 特征圖譜具有可操作性強(qiáng)、分析速度快、分辨率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，目前己成為主流分析方法［10］，既能完整表達(dá)中藥整體物質(zhì)信息及特征，又可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)［11-12］。但該技術(shù)也存在一些缺陷，例如它作為定性控制方法具有一定模糊性，不能對(duì)所有特征峰進(jìn)行定量分析；在結(jié)果分析方面采用相似度評(píng)價(jià)模式，峰面積較大的色譜峰對(duì)其影響較明顯，而較小的難以得到體現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)首先建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定生脈注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 的含有量，并在此基礎(chǔ)上建立HPLC 特征圖譜進(jìn)行質(zhì)量控制［13-15］，兩者聯(lián)用既能全面控制該制劑質(zhì)量，又能對(duì)每個(gè)共有峰進(jìn)行定量分析，從而為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料

Waters 2695 高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；SQP 電子分析天平［十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。人參皂苷Rg1（批號(hào)150924，純度≥98%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)16060402，純度≥98%）、五味子醇甲（批號(hào)110857-200405，純度≥98%）、麥冬皂苷C（批號(hào)180411-047，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司。生脈注射液來(lái)自4 個(gè)廠家，共17 批（編號(hào)1～17），每支10 mL。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)法建立

2.1.1 色譜條件 Supersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見(jiàn)圖1。由此可知，各成分分離度良好。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含四者1.027、1.074、0.247、1.101 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取注射液適量，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4 相對(duì)校正因子測(cè)定 以人參皂苷Rb1為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他3 種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝（CkAs）/（CsAk），其中Ck為其他成分質(zhì)量濃度，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，依次稀釋2.5、4、6.25、10、20 倍，作為線性溶液A～E，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以S/N＝10為定量限，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 定量限分別為9.1、13.2、6.2、17.5 ng。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.1.5.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1.5.1”項(xiàng)下線性溶液A，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD 分別為0.16%、0.21%、0.10%、0.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取注射液（廠家D，批號(hào)170504）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD 分別為0.38%、0.41%、0.62%、0.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取注射液（廠家D，批號(hào)170504）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 峰面積RSD分別為0.16%、0.22%、0.28%、0.59%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含有量已知的注射液（廠家D，批號(hào)170504）0.5 mL，共6 份，按1∶1 比例加入對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.1.5.6 耐用性試驗(yàn) 考察不同柱溫、體積流量、色譜柱、儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5～8，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5.0%）。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表6 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表7 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.7 Effects of different columns on relative correction factors

表8 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.8 Effects of different instruments on relative correction factors

2.1.6 色譜峰定位 以人參皂苷Rb1為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定其他3 種成分在不同儀器、色譜柱下的的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表9，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜5.0%）。

表9 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.9 Relative retention time of various constituents

2.1.7 樣品含有量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表10，可知2 種方法所得結(jié)果無(wú)明顯差異（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab.10 Results of content determination of various constituents（μg/mL）

2.2 HPLC 特征圖譜建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)相似度評(píng)價(jià)軟件（2004 版）建立注射液對(duì)照特征圖譜，見(jiàn)圖3，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-2865-98-2011）比較，其色譜峰分離情況更理想。再對(duì)17批樣品進(jìn)行特征圖譜采集，見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)共有峰，以3 號(hào)峰（人參皂苷Rb1）為參照，測(cè)定其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，以?xún)烧咂骄档摹?0%為范圍，結(jié)果見(jiàn)表11。

圖3 生脈注射液對(duì)照特征圖譜Fig.3 Reference characteristic chromatogram of Shengmai Injection

3 討論與結(jié)論

中成藥成分復(fù)雜，尤其是復(fù)方制劑，其種類(lèi)更為繁多，作用機(jī)制也更為復(fù)雜。藥理研究表明，中成藥不是某種單一成分發(fā)揮作用，而是多種成分同時(shí)作用在同一或不同靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮療效，因此研究單一或個(gè)別幾種成分難以全面準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［16-17］，而特征圖譜的引入很好地解決了這一問(wèn)題。

圖4 17 批樣品HPLC 特征圖譜Fig.4 HPLC characteristic chromatograms of seventeen batches of samples

表11 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積Tab.11 Relative retention time and relative peak areas of various common peaks

本實(shí)驗(yàn)中一測(cè)多評(píng)考察部分均按照王智民研究員課題組提出的“一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南”進(jìn)行［18］，并且認(rèn)為在方法學(xué)考察時(shí)除了按照指南對(duì)分析方法、供試品制備方法等進(jìn)行驗(yàn)證外，還應(yīng)關(guān)注校正因子以驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。以人參皂苷Rb1為內(nèi)標(biāo)時(shí)，能同時(shí)測(cè)定人參皂苷Rg1、五味子醇甲、麥冬皂苷C 的含有量，從而對(duì)生脈注射液中各藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，并且在該色譜條件下各色譜峰分離情況良好，解決了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)分析成本高、誤差大（選定的多個(gè)共有峰均未達(dá)到基線分離）的問(wèn)題。另外，目前在指紋/特征圖譜的定性研究中以相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，可控性不強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積對(duì)各共有峰進(jìn)行控制，并規(guī)定了兩者范圍，能從整體上控制產(chǎn)品質(zhì)量。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次將一測(cè)多評(píng)法與HPLC特征圖譜相結(jié)合來(lái)控制參麥注射液質(zhì)量，可充分發(fā)揮兩者優(yōu)勢(shì)，對(duì)該制劑同時(shí)進(jìn)行定性、定量控制，彌補(bǔ)了目前指紋/特征圖譜只能用于定性研究的不足。