王占一，廖成斌，公金艷，趙春林，孫曉梅，向 蘭

（1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250012）

石榴Punica granatumL.是石榴科石榴屬多年生木本植物［1］，在我國栽培歷史悠久，擁有豐富的資源。石榴瓤為石榴果實的內(nèi)果皮，存在于石榴籽假種皮外部間隙，《全國中藥炮制規(guī)范》規(guī)定石榴皮炮制方法為“除去雜質(zhì)，去除殘留的內(nèi)瓤及種子，洗凈，切塊，干燥，或洗凈，干燥后粉碎”［2］，可見在此過程中石榴瓤通常作為廢物被丟棄，造成資源浪費［3］。國內(nèi)已有關(guān)于石榴皮多糖［4-6］、石榴葉多糖［7］、石榴籽多糖［8］的研究，但石榴瓤作為石榴果實結(jié)構(gòu)的一部分，其所含的該成分鮮有關(guān)注。

多糖具有抗過敏［9］、調(diào)節(jié)免疫［10］、抗氧化［11］等多種生物活性，以及抑制酶活性的作用［12-13］，但關(guān)于石榴瓤多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制作用尚無報道。因此，本實驗采用Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化石榴瓤多糖提取工藝，并測定它對透明質(zhì)酸酶的抑制作用，以期為其開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HN-CQY 低溫超聲波萃取儀（上海汗諾儀器有限公司）；XFB-200 小型多功能粉碎機（永康市小寶電器有限公司）；FA1104 電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；UV-2000 紫外-可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE52CS-2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；WFZ 真空冷凍干燥機（上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 石榴于2018 年10 月采自山東省棗莊市嶧城區(qū)“萬畝石榴園”主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)棗莊學(xué)院閆志佩教授鑒定為石榴科石榴屬多年生木本植物石榴Punica granatumL，將新鮮樣品洗干凈后手工撕取瓤部分，陰干，粉碎后過60 目篩，備用。D-無水葡萄糖對照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；透明質(zhì)酸酶（5 000 U/g）、透明質(zhì)酸鉀（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；Ehrlich 試劑（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；乙酰丙酮（西隴科學(xué)股份有限公司）；DNS 顯色劑（上海譽宇新材料科技有限公司）；抗壞血酸（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）。3，5-二硝基水楊酸、苯酚、濃鹽酸、濃硫酸、氯仿、正丁醇等均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水，由棗莊學(xué)院生物學(xué)省級教學(xué)示范中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖提取與純化 精密稱取干燥的石榴瓤粉末10.0 g，置于500 mL 干燥錐形瓶中，加水至一定料液比，保鮮膜、橡皮筋封住瓶口后置于超聲波提取器中，設(shè)定超聲功率為300 W，在一定超聲溫度下提取一段時間后減壓抽濾，濾液定容至100 mL（濾液超過100 mL 時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至80 mL 左右后再定容），加入1/4 倍體積的氯仿-正丁醇混合溶劑（比例4∶1）攪拌30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液，重復(fù)3 次以除去蛋白質(zhì)。將粗多糖溶液置于透析袋（截留分子量3 500 Da）中透析36 h 以除去小分子雜質(zhì)，完畢后加入3 倍量無水乙醇，封口膜封好，靜置冷藏過夜，于第2 天過濾，濾餅復(fù)溶于水，再加入3 倍量無水乙醇，重復(fù)3 次以除去色素，得到白色多糖沉淀，真空冷凍干燥，即得精多糖，稱定質(zhì)量。將精多糖用蒸餾水溶解并定容至50 mL，作為供試品溶液，測定得率、純度，公式分別為得率＝（樣品中多糖含有量/樣品質(zhì)量）×100%、純度＝（樣品中多糖含有量/精多糖質(zhì)量）×100%。

2.2 總糖含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品50 mg，蒸餾水定容至100 mL，即得（0.5 mg/mL）。

2.2.2 方法學(xué)考察

2.2.2.1 線性關(guān)系考察 采用苯酚-硫酸法［14］。將“2.2.1”項下對照品溶液依次稀釋至10、20、30、40、50、60、70 μg/mL，各取1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入0.5 mL 5%苯酚溶液，搖勻，滴加5.5 mL 濃硫酸，搖勻，室溫下靜置30 min，在490 nm波長處測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.079 2X-0.005 5（r＝0.999 5），在1.43～10 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.2 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.2.1”項下方法測定6 次，測得總糖含有量RSD 為1.26%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3 重復(fù)性試驗 精密稱取干燥的石榴瓤粉末適量，按“2.1”項方法制備6 份供試品溶液，按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖含有量RSD 為1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取干燥的石榴瓤粉末適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、16 h 按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖含有量RSD 為0.85%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的干燥石榴瓤粉末適量，按“2.1”項下方法制備6 份供試品溶液，精密加入“2.2.1”項下對照品溶液0.5 mL，按“2.2.2.1”項下方法測定，測得總糖平均加樣回收率為101.12%，RSD 為0.92%。

2.3 還原糖含有量測定 采用DNS 顯色法［14］。精密量取“2.2.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于具塞刻度試管中，不足1.0 mL 的蒸餾水補足1.0 mL，加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑2.0 mL，沸水浴5 min 后用自來水冷卻，蒸餾水補至10 mL，于540 nm 波長處測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.017 2X-0.186 2（r＝0.999 3），在5～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 多糖含有量測定 按“2.2”項下方法測定總糖含有量，按“2.3”項下方法測定還原糖含有量，多糖含有量＝總糖含有量-還原糖含有量。

2.5 提取工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗

2.5.1.1 料液比 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定超聲時間35 min、超聲溫度45 ℃，考察粉末與水比例（料液比）1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28 對多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著提取溶劑用量增加，多糖得率呈先升后降的趨勢，料液比為1∶20 時達到最大；進一步加大提取溶劑用量后，多糖得率反而略呈下降趨勢，其原因是溶劑量過多會增加該成分損失。因此，確定料液比為1∶20 左右。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.5.1.2 超聲時間 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定料液比1∶20、超聲溫度45 ℃，考察超聲時間20、25、30、35、40、45 min 對多糖得率的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，提取20～35 min 時，多糖得率升高趨勢明顯；超過35 min 后，多糖得率反而略有下降，其原因是超聲時間過長時該成分結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。因此，確定超聲時間為35 min左右。

圖2 超聲時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polysaccharides yield

2.5.1.3 超聲溫度 精密稱取石榴瓤粉末3.0 g，固定料液比1∶20、超聲時間35 min，考察超聲溫度25、35、45、55、65、75 ℃對多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，在25～45 ℃下，多糖得率升高趨勢明顯；超過45 ℃后，多糖得率反而呈下降趨勢，其原因是溫度過高時該成分會氧化變質(zhì)或水解損失。因此，確定超聲溫度為45 ℃左右。

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharides yield

2.5.2 Box-Behnken 設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以料液比（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）為影響因素，多糖得率為評價指標（Y），應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 設(shè)計，優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

將表2 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到方程為Y＝7.09+0.13A+0.090B+0.083C-0.15AB+0.28AC+0.090BC-0.18A2-0.27B2-0.37C2，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型達到極顯著水平；失擬項P＞0.05，表明未知因素對實驗結(jié)果影響較?。籖2為98.96%，表明模型擬合程度良好，可代替真實點進行分析；各因素及其交互項、二次項均達到顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）水平。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

響應(yīng)面分析見圖4。由此可知，固定超聲溫度（C）時，因素A（料液比）、B（超聲時間）對多糖得率的影響均呈倒U 型變化；A對響應(yīng)面坡度的改變程度大于B，表明前者影響較大。同理，其他因素影響程度為A＞C、B＞C。

通過Design Expert 8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進行分析，得到最優(yōu)工藝為料液比1∶22.44，超聲時間35.30 min，超聲溫度48.50 ℃，多糖得率為7.14%，考慮到實際生產(chǎn)條件，將其修正為料液比1∶22，超聲時間35 min，超聲溫度48.5 ℃。在此優(yōu)化工藝下進行3 批驗證試驗，測得多糖得率分別為7.14%、7.12%、7.13%，平均7.13%，與預(yù)測值7.14%接近，表明模型具有較好的穩(wěn)定性。

圖4 各因素響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

2.6 抑制透明質(zhì)酸酶活性檢測

2.6.1 抑制率測定 采用Elson-Morgan 法［15］。按“2.1”項下方法測得精多糖純度約為75%，通過含有量換算，將其依次配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL 溶液，各精密量取0.5 mL 至10 mL 試管中，加入0.5 mL 透明質(zhì)酸酶（500 U/mL）混勻，37 ℃下水浴20 min，取出試管，加入0.1 mL CaCl2溶液（2.5 mol/L）混勻，37 ℃水浴20 min，取出試管，加入0.5 mL 透明質(zhì)酸鉀溶液（0.5 mg/mL）混勻，37 ℃下水浴40 min，取出試管，靜置5 min，加入2 滴NaOH 溶液（5 mol/L）、0.5 mL 乙酰丙酮溶液混勻，沸水浴15 min 后冰水浴冷卻5 min，取出試管，靜置10 min后加入蒸餾水0.5 mL、Ehrlich 試劑0.5 mL、濃HCl 2 mL，補加無水乙醇至10 mL，振搖混勻，靜置30 min后在530 nm 波長處測定吸光度，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸為陽性對照，計算透明質(zhì)酸酶抑制率（R），公式為R＝［（A0-A）/A0］×100%，其中A0為對照組吸光度（以不加樣品、酶液、透明質(zhì)酸鉀為空白對照），A為樣品組吸光度（以加樣品，不加酶液、透明質(zhì)酸鉀為空白對照）。抑制曲線見圖5。

圖5 多糖對透明質(zhì)酸酶活性的抑制曲線Fig.5 Inhibitory curves for polysaccharides on hyaluronidase activity

由此可知，在0.1～2.4 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)多糖對透明質(zhì)酸酶活性的抑制率明顯增加，在2.4 mg/mL 時最大，達67.2%，但超過2.4 mg/mL后其升高程度趨緩；多糖溶液質(zhì)量濃度（X）與抑制率（Y）之間呈正相關(guān)，方程為Y＝26.12X+4.99（R2＝0.998 2），IC50為1.723 mg/mL；抗壞血酸IC50為0.816 mg/mL，表明其作用強于多糖。

2.6.2 酶抑制動力學(xué)分析

經(jīng)前期預(yù)實驗得知，反應(yīng)體系透明質(zhì)酸酶反應(yīng)初速率維持時間≥36 min。本實驗固定多糖溶液質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL，底物透明質(zhì)酸鉀濃度為3.0 mmol/L，選擇透明質(zhì)酸酶活性2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 U/mL。研究分為2 組，1 組為實驗組，加入多糖；另1 組為空白對照組，不加入多糖而以空白溶液代替，測定反應(yīng)初速率（V），以加入反應(yīng)體系前的透明質(zhì)酸酶活性為橫坐標，初速率為縱坐標繪圖，以確定多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制作用是否屬于可逆性抑制類型［16］，結(jié)果見圖6。由此可知，無論加或未加抑制劑，曲線均通過原點，表明多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制作用屬于可逆性抑制［17］。

圖6 透明質(zhì)酸酶活性-反應(yīng)初速率曲線Fig.6 Curves for hyaluronidase activity-initial reaction rate

以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L 透明質(zhì)酸鉀為底物，加入0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL多糖溶液，測定其在18 min 時的吸光度。以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）為縱坐標，加入反應(yīng)體系前底物透明質(zhì)酸鉀濃度的倒數(shù)（1/［S］）為橫坐標繪圖，以確定多糖對透明質(zhì)酸酶抑制作用類型［18］，結(jié)果見圖7。由此可知，曲線在X軸的負半軸幾乎交于一點，屬于非競爭性抑制類型［19］，表明底物濃度升高不能降低多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制活性。

圖7 多糖Lineweaver-Burk 曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curves for polysaccharides

3 討論

本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化石榴瓤多糖提取工藝，得到最佳條件為料液比1∶22 g/mL，超聲時間35 min，超聲溫度48.5 ℃，多糖得率為7.13%，與預(yù)測值7.14%接近，表明工藝準確可靠。

透明質(zhì)酸能在具有一定活性透明質(zhì)酸酶的條件下水解，產(chǎn)生β-N-乙酰葡糖胺，后者可在堿的催化下與乙酰丙酮縮合而形成生色原，它在酸性條件下與Ehrlich 試劑縮合顯色，縮合產(chǎn)物在530 nm波長處有最大吸收，故通過可見分光光度法測定β-N-乙酰葡糖胺含有量可得知透明質(zhì)酸被水解的程度，進而間接判斷透明質(zhì)酸酶活性，該成分含有量越高，酶活性也越高，反之則越低，上述方法即為國際通用的Elson-Morgan 法。本實驗采用該方法測定石榴瓤多糖體外抑制透明質(zhì)酸酶活性，發(fā)現(xiàn)其IC50為1.723 mg/mL，表明其抑制作用較強。

由此推測，石榴瓤多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制機理可能是前者作用于后者上的活性位點，并優(yōu)先以非共價鍵結(jié)合，使后者無法再作用于底物透明質(zhì)酸，導(dǎo)致其活性暫時喪失；或兩者以共價鍵的形式結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)，使后者結(jié)構(gòu)改變，喪失其催化透明質(zhì)酸水解的活性位點，從而永久性失活。