何 艷，胡小祥，汪 毅，張 輝

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖南 郴州 423000；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

風(fēng)寒感冒顆粒是由麻黃、葛根、紫蘇葉、防風(fēng)、桂枝、白芷、陳皮、苦杏仁、桔梗、甘草、干姜11 味藥材加工而成的中藥復(fù)方制劑，具有發(fā)汗解表、疏風(fēng)散寒的作用，臨床用于治療風(fēng)寒感冒、發(fā)熱、咳嗽、頭痛、惡寒、鼻塞等癥［1］。方中麻黃解表發(fā)汗、宣肺平喘，桂枝解肌發(fā)表、溫經(jīng)散寒，兩者相須為用，共為君藥；葛根解肌退熱，紫蘇葉、防風(fēng)、白芷辛溫疏風(fēng)、散寒止痛，為臣藥；陳皮、苦杏仁、桔梗宣肺化痰止咳，干姜溫肺散寒，為佐藥；甘草調(diào)和藥性，功兼佐使之用，諸藥配伍，共奏發(fā)汗解表、化痰止咳、疏散風(fēng)寒之功效。該制劑現(xiàn)收載于衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第一冊(cè)中，但其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)里僅有“性狀”和“檢查”項(xiàng)，尚無“含有量測定”項(xiàng)，而且現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)也僅針對(duì)其中1～2 種成分進(jìn)行定量分析［2-6］，不能從整體上控制其內(nèi)在質(zhì)量。

為了更好地提高和控制風(fēng)寒感冒顆粒質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則［7］，采用HPLC法同時(shí)測定方中君藥麻黃主要成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿［8］，臣藥葛根主要成分葛根素［9］、防風(fēng)主要成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷［10］，佐藥陳皮主要成分橙皮苷［11］，使藥甘草主要成分甘草酸［12］的含有量，以期為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床用藥穩(wěn)定性提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱（美國安捷倫公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國密理博公司）；XSE-205 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥物與試劑 鹽酸麻黃堿（批號(hào)171241-201809，純度100.0%）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)171237-201510，純度99.8%）、葛根素（批號(hào)110752-201615，純度95.4%）、升麻素苷（批號(hào)111522-201511，純度94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)111523-201509，純度95.8%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201617，純度96.1%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201619，純度93.0%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。風(fēng)寒感冒顆粒（批號(hào)A20181168、A20190211，每袋裝8 g，貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司；批號(hào)ZAA1922、ZBA1803，每袋裝8 g，云南白藥集團(tuán)股份有限公司；批號(hào)818136，每袋裝8 g，葵花藥業(yè)有限公司；批號(hào)181110，每袋裝8 g，吉林長白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純（德國默克公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（含0.1%NH4Cl）（B）梯度洗脫（0～15 min，4%～7%A；15～30 min，7%～13%A；30～45 min，13%～20%A；45～60 min，20%～50%A；60～65 min，50%A；65～66 min，50%～4%A；66～70 min，4% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；0～20 min 在210 nm 波長處檢測鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，20～50 min 在250 nm 波長處檢測葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷，50～55 min 在284 nm 波長處檢測橙皮苷，55～70 min在250 nm 波長處檢測甘草酸；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品鹽酸麻黃堿8.11 mg、鹽酸偽麻黃堿6.50 mg、葛根素9.87 mg、升麻素苷5.94 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷5.76 mg、橙皮苷7.94 mg、甘草酸銨7.97 mg（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7），置于25 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，分別精密吸取2、2、8、2、2、4、4 mL，置于25 mL量瓶中，振搖，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為25.95、20.76、120.5、18.02、17.66、48.8、46.48 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 取顆粒5 袋，將內(nèi)容物倒入研缽中研細(xì)，精密稱取粉末1.5 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇-1%HCl（7∶3），稱重，超聲（300 W、40 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，甲醇-1% HCl 補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按顆粒處方工藝，分別制得缺麻黃、缺葛根、缺防風(fēng)、缺陳皮、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過濾，各精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰的分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸峰面積 RSD 分別為 0.69%、0.84%、0.26%、0.47%、0.32%、0.19%、1.60%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批顆粒（批號(hào)A20190211），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、4、10、18、24、36 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸峰面積RSD 分別為1.03%、1.06%、0.61%、1.73%、0.66%、0.90%、2.38%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒（批號(hào)A20190211），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸含有量RSD 分別為1.20%、1.89%、1.23%、2.14%、1.45%、1.35%、2.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批各成分含有量已知的顆粒（批號(hào)A20190211），研細(xì)，精密稱取0.75 g 粉末，共6 份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液（0.183 2 mg/mL 鹽酸麻黃堿1 mL、0.103 8 mg/mL鹽酸偽麻黃堿1 mL、0.335 0 mg/mL葛根素5 mL、0.157 4 mg/mL 升麻素苷1 mL、0.110 4 mg/mL 5-O-基維斯阿米醇苷 1 mL、0.226 4 mg/mL橙皮苷4 mL、0.250 7 mg/mL 甘草酸2 mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、甘草酸平均加樣回收率分別為98.96%、97.81%、99.83%、97.80%、99.90%、101.06%、96.87%，RSD 分別為2.05%、2.88%、2.23%、2.17%、1.15%、1.73%、1.10%。

2.4 樣品含有量測定 取6 批顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 檢測波長篩選 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測器，在紫外光區(qū)（190～400 nm）對(duì)各成分進(jìn)行掃描，并采集紫外光譜圖。結(jié)果，在210 nm 波長處鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿有最大吸收，在250 nm 波長處葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸有最大吸收，在284 nm 波長處橙皮苷有最大吸收，故選擇三者作為檢測波長。

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了Agilent Eclipse Plus-C18、Thermo Hypersil Gold-C18、Waters Sunfire-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱分離效果最好，峰型較佳。再考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1% 磷酸（含0.1% NH4Cl）流動(dòng)相［8，13-14］，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1% 磷酸（含0.1%NH4Cl）梯度洗脫時(shí)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰形最好，而且各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱性理想。最終，確定為“2.1”項(xiàng)下色譜條件。

3.3 提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了回流、超聲提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取率差異不明顯，但后者更簡便易行。考察了提取溶劑甲醇、70% 甲醇、1% 鹽酸甲醇、甲醇-1%HCl（7∶3），發(fā)現(xiàn)甲醇、1% 鹽酸甲醇提取時(shí)提取率較低，色譜峰拖尾較嚴(yán)重；70%甲醇提取時(shí)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿提取率較低，峰形較差；甲醇-1%HCl（7∶3）提取時(shí)各成分提取率最高，并且雜質(zhì)干擾少，色譜峰峰形良好。然后考察了提取時(shí)間20、30、40、50 min，發(fā)現(xiàn)在30 min 時(shí)各成分已基本提取完全。最終確定，最優(yōu)提取方法為甲醇-1% HCl（7∶3）超聲提取30 min。