趙 康，趙煦萌，邢亞利，張忠霞，邱會(huì)卿

中風(fēng)是一種急性腦血管疾病，由于缺血或出血導(dǎo)致腦供血不足，神經(jīng)元及其連接損失導(dǎo)致腦損傷[1]。目前批準(zhǔn)的治療缺血性中風(fēng)的方法僅限于血管阻塞的快速再通和溶栓藥物的藥理學(xué)治療。至今尚無藥物能在中風(fēng)發(fā)作后立即給藥以減少隨后發(fā)生的神經(jīng)學(xué)問題，且有超過50種審計(jì)保護(hù)劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)因療效和毒性的問題宣告失敗[2]。中藥在治療中風(fēng)的用藥歷史中，作為活血化瘀藥、熄風(fēng)藥和益氣藥。歐前胡素是從白芷、蛇床子等植物中提取分離出來的活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染、抗凋亡、改善記憶等藥理作用[3]。已有研究[4]表明歐前胡素通過降低缺血再灌注損傷大鼠模型大鼠腦組織內(nèi)促炎性細(xì)胞因子的含量， 減少損傷后的炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元，改善腦缺血癥狀。但歐前胡素對(duì)中風(fēng)的具體作用機(jī)制仍不清楚。該文旨在研究歐前胡素對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及ATP酶活力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只雄性SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，7周齡，體質(zhì)量(210±15)g，許可證號(hào)：SYXK(川)2014-189，置于溫控(22±1)℃和光控(200lux，12 h/12 h光暗循環(huán))動(dòng)物設(shè)施中常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 試驗(yàn)藥物與主要試劑歐前胡素(110826-201616)、尼莫地平(100270-201403)購(gòu)自北京食品藥品檢定研究院，化學(xué)式：C16H14O4，分子量：270.28，含量：99.6%；蘇木精-伊紅染液(D006-1-1)、TTC染液(D025-1-3)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測(cè)定試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒(A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH)(A005-1-2)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(A020-2-2)、Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒(A070-2-2)、Ca2+-Mg2+-ATP酶(A070-3-1)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1091)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti Survivin(ab469)、Caspase-3(ab13847)、Caspase-9(ab52298)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 動(dòng)物模型建立[5]與分組將大鼠用10%水合氯醛溶液(360 mg/kg)進(jìn)行麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，于頸部正中切口剪開，隨機(jī)均分為6組：假手術(shù)組、模型組、歐前胡素25、50、100 mg/kg組和尼莫地平組。除假手術(shù)組外，其余各組分離出頸動(dòng)脈血管，動(dòng)脈夾夾閉左頸內(nèi)動(dòng)脈，手術(shù)絲線結(jié)扎左頸總動(dòng)脈和左頸外動(dòng)脈近心端，松開動(dòng)脈夾，左頸總動(dòng)脈插入線栓，插入深度為18～20 mm，2 h后取出，血管復(fù)位后縫合切口，建立腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型。并灌胃歐前胡素(25、50、100 mg/kg)和尼莫地平(20 mg/kg)，連續(xù)14 d，每日灌胃1次。假手術(shù)組和模型組灌胃等量生理鹽水。最后1次灌胃后12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液(360 mg/kg)麻醉，快速斷頭取腦組織，參照大鼠腦立體定位圖譜快速取右側(cè)半球海馬組織置入收集管中, 液氮中保存。

1.4 Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能Y迷宮具有3個(gè)臂，分為起始臂、新異臂和其他臂。將新異臂用隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動(dòng)10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，大鼠被放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后4 h進(jìn)行, 抽開新異臂隔板, 大鼠由起始臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個(gè)臂停留的時(shí)間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計(jì)并分析大鼠在各個(gè)臂停留時(shí)間占總時(shí)間百分比、進(jìn)入次數(shù)及新異臂潛伏期。

1.5 HE染色將腦組織用10%福爾馬林固定并進(jìn)行石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤(rùn)濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測(cè)。并參照謝淑玲 等[6]腦組織病理評(píng)分表進(jìn)行腦組織病理評(píng)分。

1.6 TTC染色按照染液說明書，將新鮮腦組織切片置于裝有TTC染液的培養(yǎng)皿中，37 ℃避光孵育30 min，用組織沖洗應(yīng)用液將組織表面多余染色液沖洗掉，拍照并觀察樣本顏色變化，切片非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)組織發(fā)白，紅色區(qū)與灰色區(qū)之前未缺血區(qū)，計(jì)算梗死面積比例。

1.7 TUNEL染色將腦組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37 ℃作用20 min，用PBS洗滌3次，加入50 μl TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min后用PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后用PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后在熒光顯微鏡下觀測(cè)。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，細(xì)胞凋亡率(%)=平均光密度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比×100%。

1.8 SOD、MDA、GSH含量測(cè)定按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測(cè)定總SOD含量，采用可見分光光度計(jì)測(cè)定MDA、GSH含量。SOD在450 nm處測(cè)吸光度(optical density, OD)值，MDA在532 nm處測(cè)OD值，GSH在412 nm處測(cè)OD值。

1.9 LDH、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力測(cè)定按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測(cè)定LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶在636 nm處測(cè)OD值，LDH在450 nm處測(cè)OD值。

1.10 Western blot將各組大鼠腦組織在冰上溶解25 min，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入一抗Survivin(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦部功能的影響采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠腦部功能結(jié)果如表1所示。與假手術(shù)組比較，模型組新異臂進(jìn)入次數(shù)降低(t=5.066，P<0.05)，新異臂潛伏期、起始臂進(jìn)入次數(shù)、其他臂進(jìn)入次數(shù)升高(t=1.265、7.178、3.544，P<0.05)。與MACO模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組新異臂進(jìn)入次數(shù)升高(F=1.687，P<0.05)，新異臂潛伏期、起始臂進(jìn)入次數(shù)、其他臂進(jìn)入次數(shù)降低(F=53.30、0.515 0、4.316，P<0.05)。

表1 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦部功能的影響

圖1 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦組織病理?yè)p傷的影響 HE染色×200

圖2 歐前胡素對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

2.2 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦組織病理?yè)p傷的影響采用HE染色檢測(cè)各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化結(jié)果(圖1)，并對(duì)腦組織進(jìn)行病理評(píng)分(表2)。假手術(shù)組細(xì)胞組織紋理清晰，著色均勻。模型組較假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞萎縮，著色深濃，紋理紊亂，呈現(xiàn)腦組織病理?yè)p傷，病理評(píng)分升高(t=1.338，P<0.05)。歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組較MCAO模型組病理?yè)p傷程度均有改善，病理評(píng)分降低(F=17.94，P<0.05)。

2.3 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦梗死面積的影響通過TTC染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死面積結(jié)果如圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著升高(t=1.162，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組大鼠腦梗死面積顯著降低(F=15.95,P<0.05)。

表2 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠腦組織病理評(píng)分的影響

2.4 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響采用TUNEL染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖3。細(xì)胞核呈現(xiàn)黃褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=1.055，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組細(xì)胞凋亡率顯著降低(F=22.73,P<0.05)。

2.5 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的影響Western blot檢測(cè)各組大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖4、表3所示。與假手術(shù)組比較，模型組Survivin蛋白水平降低(t=1.364，P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平升高(t=1.154、1.065，P<0.05)。與模型組相比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組Survivin蛋白水平升高(F=21.56，P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9蛋白水平降低(F=79.42、71.15，P<0.05)。

圖4 Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平

2.6 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠SOD、GSH、MDA含量的影響試劑盒檢測(cè)各組大鼠SOD、MDA、GSH含量結(jié)果如表4所示。與假手術(shù)組比較，模型組SOD、GSH含量降低(t=1.959、2.585，P<0.05)，MDA含量升高(t=1.843，P<0.05)。與MCAO模型組相比較，歐前胡素50、100 mg/kg組和尼莫地平組SOD、GSH含量升高(F=11.18、13.37，P<0.05)，MDA含量降低(F=5.364，P<0.05)。

表3 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠Survivin、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響

表4 歐前胡素對(duì)各組大鼠SOD、MDA、GSH含量的影響

2.7 歐前胡素對(duì)MCAO模型大鼠LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的影響試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力結(jié)果如表5所示。與假手術(shù)組比較，模型組LDH活力升高(t=2.292，P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力降低(t=2.188、3.645，P<0.05)。與模型組比較，歐前胡素50、100 mg/kg和尼莫地平組LDH活力降低(F=26.26，P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力升高(F=19.33、2.701，P<0.05)。

表5 歐前胡素對(duì)各組大鼠LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的影響

3 討論

中風(fēng)為古代中醫(yī)“風(fēng)、癆、臌、膈”四大難病之首，是以高發(fā)病率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)嚴(yán)重威脅人類健康的一種疾病[7]。中藥以其多途徑多靶點(diǎn)的作用，在中風(fēng)的治療中取得了療效。歐前胡素是中藥白芷、獨(dú)活和當(dāng)歸中的有效成分，已有研究[8]表明歐前胡素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建MCAO大鼠模型發(fā)現(xiàn)歐前胡素具有改善腦缺血再灌注模型大鼠腦組織病理?yè)p傷的作用。

Y迷宮實(shí)驗(yàn)主要研究嚙齒類動(dòng)物的空間識(shí)別記憶能力, 該迷宮利用了嚙齒類動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性, 不需要?jiǎng)游飳W(xué)習(xí)任何規(guī)則趨利避害，能有效反映動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的識(shí)別記憶能力。本研究表明歐前胡素具有改善腦缺血再灌注模型大鼠對(duì)新環(huán)境空間認(rèn)知、行為辨別及記憶能力，提示歐前胡素可增強(qiáng)腦缺血再灌注模型大鼠對(duì)新環(huán)境的探索及記憶能力。

凋亡是細(xì)胞死亡的抑制，在正常成年組織的早期發(fā)育和生長(zhǎng)中起著重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過程中，這是一種常見的現(xiàn)象。然而在成年人的大腦中，神經(jīng)元的存活對(duì)人整個(gè)生命周期的正常功能來說更為必要。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制基因,Survivin通過直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶半胱氨酸天冬酰胺酶Caspase-3 和Caspase-7 活性來阻斷細(xì)胞凋亡過程。通過調(diào)控Survivin的表達(dá)，可刺激神經(jīng)發(fā)興奮。Caspase-3是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用,直接參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷，而活化的Caspase-9可激活Caspase-3。在缺血性神經(jīng)損傷中，抑制Caspase-3、Caspase-9活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。Wang et al[10]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過抑制氧糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模型凋亡保護(hù)神經(jīng)元。本研究顯示歐前胡素具有上調(diào)Survivin蛋白水平，下調(diào)Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的作用。提示歐前胡素通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡改善腦缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)元損傷。

氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注中起到重要作用，由于腦組織代謝旺盛、需氧量高, 導(dǎo)致生成較多的活性氧, 但腦組織自身缺少抗氧化物質(zhì)，導(dǎo)致氧化損傷。MDA是體內(nèi)脂類物質(zhì)遭受自由基攻擊后斷裂形成的氧化產(chǎn)物，其水平高低可反映氧化應(yīng)激程度[11]；GSH、SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化物酶，可清除細(xì)胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS),具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用。He et al[12]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過降低MDA含量使大腦免受腦缺血再灌注引起的過度氧化應(yīng)激損傷, 進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。余盈 等[13]研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素通過升高SOD、GSH含量減輕阿爾茨海默病模型小鼠氧化應(yīng)激損傷。本研究顯示歐前胡素具有升高腦缺血再灌注模型大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用，提示歐前胡素可能通過抗氧化途徑減少神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到治療腦缺血再灌注大鼠的作用。

血清LDH作為評(píng)價(jià)腦組織損傷的指標(biāo)，在腦缺血后腦細(xì)胞通透性增加，腦組織中LDH活性降低[14]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶參與細(xì)胞間及組織間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，由于其活性維持依賴于ATP的支持，所以其活性高低可體現(xiàn)細(xì)胞能量代謝水平。張祎 等[15]研究發(fā)現(xiàn)泄心湯通過增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性保護(hù)缺血腦組組織。本研究顯示歐前胡素具有升高腦缺血再灌注大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力，降低LDH活力的作用。提示歐前胡素通過維持細(xì)胞滲透壓，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能改善腦缺血再灌注大鼠病理?yè)p傷。

綜上，歐前胡素對(duì)腦缺血再灌注大鼠具有保護(hù)作用。通過改善病理?yè)p傷、新環(huán)境識(shí)別能力，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，抗氧化應(yīng)激。本文揭示了歐前胡素臨床治療中風(fēng)的潛力，下一步計(jì)劃研究歐前胡素在體外對(duì)腦缺血再灌注模型的影響。