桑成晨,錢 龍

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、炎癥性和系統(tǒng)性自身免疫疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致殘疾，同時(shí)它可以累及肺、心臟和眼睛等關(guān)節(jié)外器官，并且與心血管疾病、感染、淋巴瘤和預(yù)期壽命降低的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。RA的確切病因尚不清楚，許多研究提示環(huán)境和遺傳因素綜合作用參與其發(fā)病，目前認(rèn)為炎癥的小分子介質(zhì)(如花生四烯酸代謝產(chǎn)物)、自身抗體、細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子、黏附分子、表觀遺傳學(xué)、異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)均與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。表觀遺傳學(xué)與RA的研究進(jìn)展表明微小RNA(microRNA，miRNA)與RA發(fā)病機(jī)制之間有緊密關(guān)系，近年來有學(xué)者研究證實(shí)外泌體可通過傳遞miRNAs參與RA發(fā)病機(jī)制[1]。該研究通過檢測(cè)miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血漿外泌體中的表達(dá)水平進(jìn)一步探討外泌體miRNAs和RA之間的確切聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2017年10月～2019年10月的RA住院患者56例，按照患者基于C反應(yīng)蛋白(C reaction protein，CRP)水平計(jì)算的28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(disease activity score 28-CRP，DAS28-CRP)來區(qū)分RA活動(dòng)度，其中病情活動(dòng)組(DAS28-CRP≥3.2)和穩(wěn)定組(DAS28-CRP<2.6)各28例。同時(shí)收集24例健康體檢者作為對(duì)照組。本研究獲得研究對(duì)象知情同意及安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)所有病例組患者診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組為同期健康體檢者，研究對(duì)象均為無血緣關(guān)系漢族人，各組年齡及性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。選取的研究對(duì)象均排除感染、代謝、腫瘤和其他自身免疫性疾病。

1.3 一般資料記錄所有患者以下臨床資料：姓名、年齡、性別、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)滴度、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，Anti-CCP)滴度、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、CRP、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count,TJC)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count,SJC)、關(guān)節(jié)超聲、關(guān)節(jié)平片等，并計(jì)算RA患者DAS28評(píng)分。

1.4 實(shí)驗(yàn)流程采集RA患者與正常人晨血標(biāo)本10 ml，離心取上層血漿后，按照試劑盒說明書使用Qiagen公司的外泌體提取試劑盒(exoEasy Maxi kit)提取外泌體。以miR-451a作為內(nèi)對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-qPCR)對(duì)外泌體中miR-16-5p和 miR-223-3p進(jìn)行定量檢測(cè)，使用2-△△CT計(jì)算其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 一般資料統(tǒng)計(jì)分析在RA組及健康對(duì)照組，RA病情活動(dòng)組及穩(wěn)定組中，性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 RA組與健康對(duì)照組的一般資料比較

表2 RA病情活動(dòng)組與穩(wěn)定組的一般資料比較

2.2 RA組和健康對(duì)照組血漿外泌體中miR-16-5p的表達(dá)RA組及健康對(duì)照組血漿外泌體中均檢測(cè)到miR-16-5p，其在RA組[1.852 (1.084，2.532)]中的表達(dá)高于健康對(duì)照組[0.995 (0.572，1.798)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.310，P=0.021)(圖1)。

圖1 miR-16-5p在RA組和健康對(duì)照組血漿外泌體中的表達(dá)

2.3 RA病情活動(dòng)組和穩(wěn)定組血漿外泌體中miR-16-5p的表達(dá)血漿外泌體miR-16-5p在RA活動(dòng)組[1.427(0.950,2.314)]中的表達(dá)水平與RA穩(wěn)定組[1.970(1.248,2.857)]相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.573，P=0.116)(圖2)。

2.4 RA組和健康對(duì)照組血漿外泌體中miR-223-3p的表達(dá)RA組與健康對(duì)照組外泌體中均檢測(cè)到miR-223-3p，RA組[106.611(46.813，223.841)]血漿外泌體miR-223-3p的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組[47.586 (8.115，101.347)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.845，P=0.004)(圖3)。

圖2 miR-16-5p在RA病情活動(dòng)組和穩(wěn)定組血漿外泌體中的表達(dá)

圖3 miR-223-3p在RA組和健康對(duì)照組血漿外泌體中的表達(dá)

2.5 RA病情活動(dòng)組和穩(wěn)定組血漿外泌體中miR-223-3p的表達(dá)血漿外泌體miR-223-3p在RA活動(dòng)組[199.615(104.944，305.090)]中的相對(duì)表達(dá)水平比RA穩(wěn)定組[53.993(21.524，107.707)]升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.097，P=0.000)(圖4)。

圖4 miR-223-3p在RA病情活動(dòng)組和穩(wěn)定組血漿外泌體中的表達(dá)

2.6 血漿外泌體miR-16-5p、miR-223-3p相對(duì)表達(dá)水平與臨床相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性相關(guān)性結(jié)果分析顯示，RA患者血漿外泌體miR-16-5p與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等臨床指標(biāo)均無相關(guān)性(P>0.05)；miR-223-3p相對(duì)表達(dá)水平與患者RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均無相關(guān)性，但與TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 RA患者血漿外泌體miRNAs相對(duì)表達(dá)和臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

RA病程中關(guān)節(jié)的破壞給患者、社會(huì)均造成了沉重負(fù)擔(dān)，明確RA的發(fā)病機(jī)制、尋找其早期診斷的生物標(biāo)志物及開發(fā)理想的RA治療藥物是迫切的醫(yī)學(xué)需求。外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌可進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境的異質(zhì)性囊泡，其內(nèi)包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多種核酸等物質(zhì)，Takamura et al[2]鑒定了RA成纖維樣滑膜細(xì)胞系(即MH7A)的外泌體RNA，發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-146a在源自MH7A的外泌體中表達(dá)，并且在TNF-α刺激后的外泌體中的表達(dá)是升高的，提示外泌體可能通過傳遞miRNAs參與RA發(fā)病機(jī)制。miRNAs作為進(jìn)化高度保守的一類小分子RNA參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和免疫功能的調(diào)節(jié)，研究顯示miR-16[3-4]、miR-223[5-6]在 RA患者的血清、外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織等標(biāo)本中均異常表達(dá)，因miRNAs與外泌體結(jié)合后不受內(nèi)源性核糖核酸酶活性的影響而穩(wěn)定存在[7]，表明外泌體miRNAs有成為新的疾病生物標(biāo)志物的潛能。故本研究通過檢測(cè)miR-16-5p和miR-223-3p在血漿外泌體中的表達(dá)水平，并進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討外泌體miRNAs在RA發(fā)病及疾病進(jìn)展中的意義。

miR-16被位于人類3號(hào)和13號(hào)染色體上的兩個(gè)基因編碼，Jing et al[8]通過分析從人細(xì)胞中分離的miR-16的序列發(fā)現(xiàn)miR-16包含可以與TNF-α mRNA中的ARE基因配對(duì)的UAAAUAUU序列，破壞miR-16前體pre-miR16-1后可顯著降低HeLa細(xì)胞中miR-16的水平，并延長了TNF-a mRNA的半衰期，從而推測(cè)其參與ARE介導(dǎo)的TNF-α mRNA降解過程，而TNF-α在RA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，這似乎說明miR-16可能參與RA的發(fā)生。Wu et al[9]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中的Th17和Treg細(xì)胞中miR-16的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3的表達(dá)密切相關(guān)，說明miR-16可能通過影響RORγt和FoxP3的表達(dá)而參與RA患者的Th17/Treg失衡。隨后孫寅 等[4]發(fā)現(xiàn)miR-16在RA患者血漿、PBMC和關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，其表達(dá)水平由低到高分別為PBMC、關(guān)節(jié)滑液和血漿，且RA患者血漿miR-16的表達(dá)與DAS28呈負(fù)相關(guān)，PBMC中miR-16的表達(dá)與DAS28評(píng)分、ESR及CRP呈正相關(guān)。而Murata et al[10]研究結(jié)果顯示滑液中miR-16的濃度與RA臨床指標(biāo)MMP-3、CRP、ESR、DAS28、SJC、TJC均無相關(guān)性。本研究檢測(cè)了RA患者和健康對(duì)照組的血漿外泌體miR-16-5p的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在RA患者中的表達(dá)高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示其可能參與RA發(fā)病。但外泌體miR-16-5p在RA病情活動(dòng)組及穩(wěn)定組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且其表達(dá)水平與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等臨床指標(biāo)均無相關(guān)性(P>0.05)，結(jié)合既往研究中miR-16在RA患者血漿、關(guān)節(jié)滑液和PBMC中的表達(dá)水平存在明顯差異，考慮miR-16在不同標(biāo)本中的來源不同，并可能存在不同的miRNA表達(dá)譜，需要加大樣本量進(jìn)行更深入的研究明確外泌體miR-16參與RA發(fā)病的作用機(jī)制。

miR-223位于人類X染色體q12上，F(xiàn)ulci et al[6]首次表征了RA患者外周T淋巴細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，與正常人相比，RA患者CD4+原始T淋巴細(xì)胞中miR-223的表達(dá)顯著升高，而正常人的原始CD4 T細(xì)胞用T細(xì)胞抗原受體刺激后也未檢測(cè)到miR-223的表達(dá)，說明RA患者中miR-223的過表達(dá)與RA發(fā)病相關(guān)。Sugatani et al[11]的研究顯示miR-223通過轉(zhuǎn)錄因子PU.1/miR-223/核因子1A(nuclear factor1-A，NFI-A)/巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)反饋通路調(diào)控破骨細(xì)胞的生成。在這個(gè)反饋環(huán)中，M-CSFR可以上調(diào)PU.1水平刺激miR-223的表達(dá)，過表達(dá)的miR-223下調(diào)NFI-A水平促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，同時(shí)NFI-A表達(dá)水平的降低使M-CSFR的表達(dá)水平升高，而M-CSFR對(duì)破骨細(xì)胞的分化和功能至關(guān)重要。隨后Li et al[5]在RA患者關(guān)節(jié)滑膜和CIA小鼠模型中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Sugatani et al[11]的結(jié)論，提示miR-223可能成為RA的潛在治療靶點(diǎn)。近期孫廣 等[12]研究了RA患者血清外泌體miR-223的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)RA患者血清外泌體miR-223的相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組，且其表達(dá)量與RA患者DAS28評(píng)分、血清Anti-CCP滴度、RF滴度 、CRP及ESR水平正相關(guān)。在本研究中，相對(duì)于健康對(duì)照組，RA患者血漿外泌體miR-223-3p的表達(dá)增高(P<0.05)，這與孫廣 等[12]的研究結(jié)果一致，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-223-3p在RA活動(dòng)組的表達(dá)水平高于RA穩(wěn)定組(P<0.05)，進(jìn)一步說明外泌體miR-223-3p可能參與RA疾病的發(fā)展。相關(guān)性分析結(jié)果顯示RA患者血漿外泌體miR-223-3p相對(duì)表達(dá)水平與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均無相關(guān)性(P>0.05)，這個(gè)結(jié)果與孫廣 等[12]的研究結(jié)果存在不同，考慮可能有以下原因：① 目前的大量研究在RF滴度、Anti-CCP滴度 、ESR及CRP水平與RA疾病活動(dòng)度是否相關(guān)的問題上存在分歧，這可能與不同實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定出的指標(biāo)值存在差異以及活動(dòng)期RA患者的炎癥指標(biāo)與滑膜炎嚴(yán)重程度并不一致[13]有關(guān)；② 來自于同一發(fā)夾結(jié)構(gòu)pre-miRNA的相反兩臂命名時(shí)后綴加“-3p”(表示從3′ 端的臂加工而來)或“-5p”(表示從5′ 端的臂加工而來)，如miR-223-3p 和miR-223-5p，它們?cè)诓煌M織的表達(dá)量不同，本研究選取表達(dá)量較高且特異性較高的miR-223-3p進(jìn)行研究，而孫廣 等[12]的研究中并未提及測(cè)定的miR-223序列；③ 本研究中選擇的內(nèi)參與相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法與孫廣 等[12]的不同，這可能導(dǎo)致了不同的結(jié)果。同時(shí)本研究中RA患者血漿外泌體miR-223-3p相對(duì)表達(dá)水平與TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR均呈正相關(guān)(P<0.05)，這說明外泌體miR-223-3p不僅參與RA的發(fā)病，還可能用來評(píng)估RA患者的疾病活動(dòng)情況，但其可否成為RA的潛在治療靶點(diǎn)還需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究通過檢測(cè)miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血漿外泌體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其有可能成為RA篩查、診斷、評(píng)估病情的生物標(biāo)志物?？紤]到目前各種研究中定量方法、不同患者的疾病活動(dòng)和藥物治療情況以及樣本類型(全血、分離細(xì)胞亞群、滑膜組織、滑液等) 的不一致性，應(yīng)當(dāng)注意這些研究結(jié)果間的偏差，這可能會(huì)推遲miRNAs作為RA疾病生物標(biāo)志物的應(yīng)用。