彭松林 何同忠 陳欣 陳高揚(yáng) 王尚 龍燦玲 譚寶玉

骨質(zhì)疏松是21 世紀(jì)面臨的最嚴(yán)重的老齡問(wèn)題之一［1-4］，骨質(zhì)疏松病人骨量和骨密度持續(xù)降低，骨微觀結(jié)構(gòu)退化［5］且很難愈合，是造成老年人生活質(zhì)量下降的主要原因之一。長(zhǎng)期不愈合的骨折還會(huì)導(dǎo)致畸形。部分病人長(zhǎng)期臥床，會(huì)造成骨質(zhì)疏松進(jìn)一步加劇，并出現(xiàn)褥瘡等一系列并發(fā)癥。嚴(yán)重的并發(fā)癥如肺衰竭等甚至?xí)?dǎo)致死亡。因此，骨質(zhì)疏松引起的骨折問(wèn)題不容忽視。近些年來(lái)，骨組織工程學(xué)的迅速發(fā)展在骨再生領(lǐng)域得到廣泛的研究和認(rèn)同，開(kāi)發(fā)新型骨修復(fù)材料成為骨組織工程中的研究重點(diǎn)，如何更好地建立生物材料和原生骨之間的聯(lián)系，治療骨質(zhì)疏松骨折，是如今骨組織材料的重要研究方向。

局部注射骨水泥在一段時(shí)期內(nèi)受到一定的關(guān)注，但由于骨水泥注射時(shí)流動(dòng)性不佳，無(wú)法降解，不具備生物活性，因此仍未取得突破性進(jìn)展［6］。因此開(kāi)發(fā)滿足理想條件的骨修復(fù)材料具有重要的研究意義。聚酯彈性體由于其自身良好的生物降解性及可調(diào)控的力學(xué)性能被廣泛應(yīng)用于骨組織工程中［7-9］。本研究制備了一種兼具優(yōu)良力學(xué)性能和生物相容性的光交聯(lián)聚酯彈性體，即聚辛二醇-檸檬酸-衣康酸，擬探究其力學(xué)性能以及細(xì)胞相容性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

主要設(shè)備：萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（Shimadzu 公司，日本），高速低溫臺(tái)式離心機(jī)（Beckman Coulter公司，美國(guó)），電子分析天平（Mettler Toledo公司，瑞士），恒溫磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司，中國(guó)），電熱恒溫振蕩水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Esco 公司，新加坡），熒光倒置顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biotek 公司，美國(guó)），核磁共振譜儀（JNM ECS 300，Jeol公司，日本），流變儀（Discovery，DHR-2，TA儀器公司，美國(guó)）。

主要試劑：1，8-辛二醇、檸檬酸、衣康酸、鍶-羥基磷灰石（Sigma 試劑公司，美國(guó)）；二氧六環(huán)、無(wú)水乙醇（阿拉丁試劑公司，中國(guó)）。

二、聚酯彈性體的制備

（一）通過(guò)高溫縮聚反應(yīng)制備親疏水片段聚合物

將1，8-辛二醇和檸檬酸按照3∶2的摩爾比例放入250 ml 的三頸燒瓶中，將其放入油浴鍋中，溫度調(diào)至160～165 ℃，通入氮?dú)?，待物質(zhì)完全熔解之后，將油浴鍋的溫度調(diào)至140 ℃，繼續(xù)反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后加入100 ml 無(wú)水乙醇使其完全溶解，再用超純水按照1∶1 的比例使高分子預(yù)聚物沉淀下來(lái)，用10 000 rpm/min 的離心速度離心10 min，保留沉淀。沉淀離心重復(fù)三次。放入40 ℃真空干燥箱中去除殘留水分，得到純化的親疏水片段聚合物。

（二）親疏水片段聚合物的雙鍵化

將衣康酸加入制備得到的親疏水片段聚合物中，N2保護(hù)下，高溫充分?jǐn)嚢杌靹?。然后?40 ℃條件下反應(yīng)3 h，得到雙鍵化的親疏水片段聚合物。衣康酸占親疏水片段聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

（三）聚辛二醇-檸檬酸-衣康酸的制備

將89%的雙鍵化的親疏水片段聚合物（親水片段為衣康酸和檸檬酸，疏水片段為1，8-辛二醇），1%的光引發(fā)劑I2959，10%的鍶-羥基磷灰石，超聲90 s混勻，紫外燈下照射10 min（2焦耳）成型。

三、聚酯彈性體的性能測(cè)試

（一）聚酯彈性體分子量測(cè)試和結(jié)構(gòu)分析

結(jié)構(gòu)分析通過(guò)測(cè)試核磁共振圖譜來(lái)表征。聚酯彈性體溶解在二甲基亞砜-d6（DMSO-d6）中，置于5 mm外徑管中，使用250 MHz核磁共振譜儀進(jìn)行1HNMR分析。1H-NMR譜圖的化學(xué)位移以百萬(wàn)分之一（ppm）記錄，相對(duì)于四甲基硅烷（TMS，0.00 ppm）作為內(nèi)部參考。

（二）聚酯彈性體的力學(xué)性能測(cè)試

利用模具將聚酯彈性體制備成直徑6 mm、高12 mm 的圓柱。采用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)裝置進(jìn)行聚酯彈性體的壓縮試驗(yàn)，力學(xué)試驗(yàn)機(jī)用恒定十字頭速率（20 mm/min）向下壓縮試樣，得到形變-負(fù)載曲線。當(dāng)圓柱體破裂或已達(dá)上屈服點(diǎn)時(shí)停止。壓縮模量為應(yīng)力-應(yīng)變曲線的斜率。

（三）聚酯彈性體的流變性能測(cè)試

流變性能通過(guò)流變儀進(jìn)行測(cè)試。將制備好的聚酯彈性體片材置于臺(tái)上，進(jìn)行頻率掃描時(shí)，其設(shè)置的參數(shù)為溫度37℃，應(yīng)變?yōu)?%，頻率為0.1～100 Hz。進(jìn)行溫度掃描時(shí)，其設(shè)置的參數(shù)為應(yīng)變1%，頻率為10 Hz，溫度范圍0～100 ℃。

（四）聚酯彈性體負(fù)載特立帕肽（PTH）藥物的研究

將制備好的聚酯彈性體圓柱（直徑6 mm、高12 mm）浸泡于濃度為5 mg/ml 的PTH 溶液中24 h，隨后取出聚酯彈性體，利用ELISA 試劑盒檢測(cè)溶液中PTH 的濃度。通過(guò)浸泡前后的濃度變化來(lái)計(jì)算PTH 的吸附量。其次，再將已吸附PTH 的彈性體浸泡在5 ml的中性PBS中，37 ℃下在第1、2、3、4、5、6、7、11 d 時(shí)分別取1 ml 上清液并補(bǔ)給同等量的PBS，所取的上清液置于離心管中待測(cè)。包載量計(jì)算公式為：（測(cè)試濃度-5 mg/ml）/5 mg/ml×100%。

四、聚酯彈性體的生物相容性研究

將小鼠成肌細(xì)胞（C2C12 細(xì)胞）復(fù)蘇后更換DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁消化至懸液中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下將細(xì)胞以1×104個(gè)/cm2的濃度稀釋在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）中備用。將聚酯彈性體制備成圓片狀（直徑為1 cm，厚度為5 mm），浸泡在75%乙醇2 h 滅菌后，PBS 洗滌3次，隨后鋪在12孔培養(yǎng)板底部，將細(xì)胞的培養(yǎng)基懸液加入培養(yǎng)板中，并置于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞在培養(yǎng)第1天和第3 天時(shí)的生長(zhǎng)情況，利用MTS 增殖檢測(cè)試劑盒及Calcein-AM/PI/活死染色法探究聚酯彈性體對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，其步驟主要參照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。

MTS 具體操作為：以正常的細(xì)胞培養(yǎng)板作為對(duì)照，以聚酯彈性體為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)1、3 d后檢測(cè)細(xì)胞活力。將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，棄培養(yǎng)基后更換200 μl新培養(yǎng)基，并同時(shí)加入40 μl celltiter 液體，在37°C 培養(yǎng)箱中孵育2 h。將此時(shí)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至96 孔板中，每孔100 μl，整個(gè)過(guò)程需避光，盡量不產(chǎn)生氣泡，將轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基后的培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，在490 nm吸光度處進(jìn)行測(cè)量。

Calcein-AM/PI/活死染色法具體步驟為：在5 ml的PBS溶液中加入10 μl Calcein-AM 儲(chǔ)存液和15 μl PI 儲(chǔ)存液，混勻備用。將培養(yǎng)1、3 d 后的細(xì)胞用Trypsin-EDTA消化，離心收集細(xì)胞，加入PBS制備細(xì)胞懸液。取100 μl染色工作液與200 μl細(xì)胞懸液混合，在37 ℃培養(yǎng)15 min。在（490±10）nm 激發(fā)波長(zhǎng)下同時(shí)觀察黃綠色熒光的活細(xì)胞和紅色熒光的死細(xì)胞。

五、聚酯彈性體/PTH 對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs細(xì)胞）生長(zhǎng)狀況的影響

首先將PTH溶于PBS中，配置成濃度為4 mg/ml的溶液，制備好的聚酯彈性體浸泡于PTH 溶液中。浸泡24 h后，采用步驟3中的方法，先將聚酯彈性體在12孔培養(yǎng)板底部，隨后將hMSCs細(xì)胞均勻鋪種于上述培養(yǎng)板上并置于5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/cm2，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。采用Calcein-AM/PI 法觀察hMSCs 的生長(zhǎng)狀況。其操作同上。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所收集得到的原始數(shù)據(jù)運(yùn)用美國(guó)OriginLab公司的Origin 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理并根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果繪制圖表。

結(jié) 果

一、聚酯彈性體的結(jié)構(gòu)分析

從核磁共振圖譜圖1 中，可知通過(guò)高溫縮聚制備得到的聚合物含有碳碳雙鍵（5.5～6.25 ppm），同時(shí)具有成骨活性的檸檬酸也成功地接枝在聚酯分子上了（2.5～2.8 ppm）。

二、聚酯彈性體的力學(xué)性能分析

由衣康酸（Mw=130），1，8 辛二醇（Mw=146）以及檸檬酸（Mw=192）以2∶5∶3的比例制備的聚酯彈性體其抗壓模量高達(dá)23 MPa。其次通過(guò)流變分析來(lái)看，圖2 a 中，聚酯彈性體的G’和G”隨頻率的增大而增大，表明其具有很好的粘彈性，且在高溫下變化不大（圖2 b），粘彈性能較穩(wěn)定。

三、聚酯彈性體負(fù)載PTH藥物的研究

通過(guò)測(cè)試吸附前后PTH 的濃度差來(lái)確定PTH在彈性體中的包載量。根據(jù)計(jì)算公式得出PTH 的包載量為75%。隨后通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)彈性體中PTH 的累積釋放量如圖3 所示。從圖中可以看出，前3 d PTH釋放比較快，累積釋放率達(dá)到50%左右；在第7 天到第11 天之間變化不大，說(shuō)明PTH 在第7天時(shí)釋放已達(dá)到飽和。

四、聚酯彈性體的生物相容性分析

圖2 c 為通過(guò)MTS 測(cè)定C2C12 細(xì)胞在聚酯彈性體環(huán)境下的細(xì)胞活性，可以看出，在培養(yǎng)第1天和第3天時(shí)，細(xì)胞存活率能達(dá)到70%以上，尤其是在第三天，細(xì)胞存活率接近100%，表明所制備的聚酯彈性體具有良好的生物相容性。此外通過(guò)Calcein-AM/PI/活死染色法進(jìn)一步證明細(xì)胞在聚酯彈性體表面仍具有良好的細(xì)胞形態(tài)（圖4 b）。

五、聚酯彈性體對(duì)hMSCs細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，聚酯彈性體/PTH 表面的hMSCs 細(xì)胞狀態(tài)更加良好，且形態(tài)更多的表現(xiàn)為梭形（圖4 d）。

討 論

骨質(zhì)疏松及其導(dǎo)致的骨折在我國(guó)已構(gòu)成一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題。作為僅次于心血管疾病的人類第二大危害性疾病，如何防治骨質(zhì)疏松已成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)，也是我國(guó)“人口與健康”研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。然而當(dāng)前臨床上治療骨質(zhì)疏松的藥物主要通過(guò)抑制骨吸或促進(jìn)骨形成來(lái)增加骨量，但存在價(jià)格昂貴、療效不明確、長(zhǎng)期使用有下頜骨壞死等并發(fā)癥的弊端［10-11］。近些年來(lái)，骨組織工程的興起和發(fā)展為骨科相關(guān)疾病的預(yù)防和治療帶來(lái)希望。越來(lái)越多的研究學(xué)者致力于開(kāi)發(fā)能夠適應(yīng)骨組織特性的生物材料［12-13］。

圖1 聚酯彈性體的核磁共振譜（R1、R2代表羥基或聚合物鏈）

圖2 聚酯彈性體的G’和G”隨頻率變化圖譜（a），G’代表儲(chǔ)能模量，G”代表?yè)p耗模量；聚酯彈性體的G’和G”隨溫度變化圖譜（b）；C2C12細(xì)胞在聚酯彈性體表面的活性分析（c）

圖3 PTH的累計(jì)釋放曲線

理想的骨修復(fù)材料應(yīng)該具備以下優(yōu)點(diǎn)：①機(jī)械耐受性，以小梁骨為準(zhǔn)，抗壓強(qiáng)度應(yīng)大于5 MPa，抗壓模量在45～100 MPa 之間；②良好的生物相容性，能夠不影響細(xì)胞在其表面正常生長(zhǎng)，且不干擾周圍骨細(xì)胞的自然再生過(guò)程［14］。③成骨活性，材料本身或添加成骨誘導(dǎo)因子來(lái)誘導(dǎo)骨再生。

圖4 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 a、b：C2C12細(xì)胞在對(duì)照組和聚酯彈性體表面的生長(zhǎng)狀況（a為對(duì)照組，b為聚酯彈性體組，10×）；c、d：hMSCs細(xì)胞在對(duì)照組和聚酯彈性體/PTH表面的生長(zhǎng)狀況（c為對(duì)照組，d為聚酯彈性體組，20×）

本研究中，由1，8-辛二醇、檸檬酸和衣康酸制備的彈性體兼具優(yōu)良的力學(xué)性能、任意成型性和良好的生物相容性。其中的檸檬酸分子，已被證實(shí)在新生骨組織形成與骨表面磷、鈣離子礦化成骨的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［15］，檸檬酸鹽對(duì)骨結(jié)構(gòu)的磷灰石晶體結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定也具有重要影響。研究學(xué)者提出成骨細(xì)胞“檸檬酸化”的新概念，既成骨細(xì)胞代謝過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行三羧酸循環(huán)而產(chǎn)生多余的檸檬酸會(huì)被排到細(xì)胞外，在機(jī)體的自我調(diào)控下檸檬酸大量聚集于細(xì)胞外基質(zhì)，并由此產(chǎn)生骨組織鈣結(jié)節(jié)，這個(gè)環(huán)節(jié)是BMSCs 向成骨細(xì)胞分化并礦化形成新骨的重要部分，對(duì)于新生骨組織形成具有決定性作用［16］。其次衣康酸含有可光交聯(lián)的雙鍵官能團(tuán)，使得該聚酯彈性體具有良好可注射性、可任意成型。通過(guò)力學(xué)性能測(cè)試該聚酯彈性體的抗壓強(qiáng)度大于20 MPa，且具有很好的粘彈性能，不易發(fā)生形變，能夠滿足機(jī)械組織的耐受性。此外，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該彈性體可以維持C2C12細(xì)胞和hMSCs細(xì)胞的活性，生物相容性良好。為進(jìn)一步豐富彈性體的功能，將其吸附藥物分子PTH，可實(shí)現(xiàn)對(duì)PTH 的緩慢釋放。

本研究制備的新型彈性體為骨質(zhì)疏松骨折治療提供新的治療策略。本研究也存在不足之處，雖然PTH已經(jīng)被證實(shí)具有促進(jìn)骨修復(fù)的效果，但文中未對(duì)彈性體包載PTH 復(fù)合體系的成骨特性進(jìn)行詳細(xì)研究，未來(lái)將重點(diǎn)研究其作為骨缺損修復(fù)材料的特性。